ブルー ネイティブ ポリアクリルアミドゲル電気泳動法と免疫ブロットを使用して培養されたひと細胞のミトコンドリア呼吸鎖複合体の解析

spaNOTE: このプロトコルは Hilander ら13によって関連付けられている文書に基づいています。 1 バッファーおよび解決の準備 注: すべてのバッファーとプロトコルで使用されるソリューションを表 1にまとめます。バッファーの指定されたボリュームは、準備し、10 個のサンプルを実行するための十分です。すべてのバッファーは、+4 ° C で 1 年間保存できます。 1.5 M アミノカプロン酸、150 mM 蒸留水 (dH2O) で Bis トリスを含むゲル バッファー x 3 の 20 の mL を準備します。7.0 に pH を調整します。 DH2o ・ 2 M アミノカプロン酸 10 mL を準備します。 次を組み合わせることによりミトコンドリアのバッファーの 1 つの mL を準備: ゲルのバッファー、2 M アミノカプロン酸 0.5 mL、500 ミリメートルの EDTA の 4 μ L x 3 の 0.5 mL。 1,000 mL の 15 mM ビス トリス、dH2O. 調整 pH 7.0 のトリシンの 50 mM を含む陰極バッファーを準備します。 青い Coomassie G-250 の 0.04 g を 200 mL の陰極バッファーに追加することで 200 mL の青い陰極バッファーを準備します。 1,000 mL の 50 mM ビス トリス dH2O. 調整 pH 7.0 を含む陽極バッファーを準備します。 2.5 ml 5% ブルー 750 mM アミノカプロン酸を含むサンプル バッファーの dH2O. G-250 2. ミトコンドリア lysates の準備 セルをコレクション前日プレートします。143B または HEK293 細胞使用ダルベッコは 10% 牛胎児血清 1 %l-グルタミン 100 mg/mL ペニシリンとストレプトマイシン 100 mg/mL イーグル培地 (DMEM) を変更しました。37 ° c 5% CO2加湿雰囲気で細胞文化のインキュベーターで細胞を成長します。コレクションの日に各サンプルのために少なくとも 500,000 のセルがあることを確認します。 一度氷冷 PBS のセルは水洗い。プレートから細胞をデタッチしないでください。細胞をこすりし、+4 ° c. で 10 分の 800 x gでそれらをペレット 氷冷 PBS で 2 回細胞ペレットを洗浄し、ステップ 2.2 のように遠心分離機します。市販キットを用いたブラッドフォード法によるタンパク質の濃度を測定します。+4 ° c. で 10 分の 800 x gで細胞をペレットします。注: セルのコレクションの後 +4 ° C ですべての手順を実行し、ボルテックスにかけないでください。 20 mL の PBS に 100 x プロテアーゼ ・ インヒビターの 200 μ L を追加することでプロテアーゼ阻害剤を 20 mL の PBS を準備します。氷の上を保ちます。最終的なタンパク質濃度 5 mg/mL のプロテアーゼ阻害剤と PBS で細胞を再懸濁します。 5 mg/mL で細胞を再懸濁しますに必要なプロテアーゼ阻害剤と PBS のボリュームを計算するためには、各サンプルの蛋白質の量を計算します。この計算手順 2.3、2.3 の手順で洗浄後、細胞を再懸濁すため PBS のボリュームでタンパク質濃度を使用します。 プロテアーゼ阻害剤と PBS の 3.3 mM ジギトニンの 1 mL を準備します。1.65 mM の最終的な集中に 3.3 mM ジギトニンを追加します。よく混ぜ、氷上で 5 分間インキュベートします。 プロテアーゼ阻害剤と PBS の 3.3 mM ジギトニンの 1 mL を準備するには、沈殿物、されるまでは表示とクールな氷の上すぐに 100 ° C で 1 mL の PBS のジギトニン 4 mg を溶解します。ジギトニン溶液 1 mL に 100 x プロテアーゼ ・ インヒビターの 10 μ L を追加します。注: は、ジギトニンの新鮮なソリューションのみを使用します。注意: ジギトニンは有害です!フェイス マスク、手袋、白衣を使用します。 プロティナーゼの抑制剤 (2.4 の手順で準備) を持つ PBS を 1.5 mL の最終巻に追加します。10 分間、10,000 × g で遠心分離 + 4 ° C上澄みを除去します。この手順では、ミトコンドリアをペレットします。 ミトコンドリアのバッファーでミトコンドリアのペレットを再懸濁します。ミトコンドリアのバッファーのボリュームは、2.4 の手順で PBS のボリュームの半分です。 (2.4 の手順で準備) プロテアーゼ阻害剤を含む PBS で新鮮な 10% ラウリル maltoside を準備します。1 mL は、10 個のサンプルに対して十分です。最終濃度 1% に 10% ラウリル maltoside を追加します。(このステップは幾つかの時間まで長くすることができます) 15 分間氷の上を孵化させなさい。 20,000 x gで 20 分間遠心 + 4 ° C上清を新しいチューブに収集します。キットを使用してブラッドフォード法によるタンパク質の濃度を測定します。サンプル バッファー、ラウリル maltoside ステップ 2.8 で使用量の半分のボリュームを追加します。サンプルは、最大 6 ヶ月間-80 ° C で保存できます。 3. BN ページの勾配ゲルの調製 室温で BN ページのグラデーションのゲルを注ぎなさい。撹拌プレート上グラデーション メーカーを置き、蠕動ポンプにフレキシブル チューブを接続します。注入チューブ針セットを接続します。グラデーションのメーカーの近位チャンバー内に磁性攪拌器を配置します。10 分間最大ポンプ速度で dH2O とチューブを洗浄します。 空のチューブとグラデーションのメーカー。ピペットを使いを使用すると、グラデーションのメーカーのチャンバー間のチャネルに、残った dH2O を削除します。チャネルとバルブとチューブを閉じます。 鋳枠とクランプを使用して底面の穴には、ホルダーに 2 枚のガラス板を組み立てるし、スタンドの上に置きます。もっとまたはより少なく水収支とストレート表面にあることを確認します。針の場所は、ガラス板との間のチューブに接続されています。 6% と 15% のゲル ソリューション (表 2) を準備します。氷の上を保ちます。過硫酸アンモニウム (AP) と tetramethylenediamine (TEMED) (重合開始) 追加最後。優しく空気を避けるためにミックスを泡します。 6% ゲルでグラデーション ジェル ミキサー チューブ室の近位端と遠位端 15% ゲルでをロードします。ゲルの総量は、ガラス板との間の分離ゲルの体積に等しいはずです。したがって、1 つ 8.3 × 7.3 cm サイズのゲルの 6% ゲルの勾配ゲル ミキサーに 15% ゲルの 2.1 mL 2.6 mL を使用します。 磁性攪拌器、スイッチ、チューブとグラデーションのメーカーのチャンバー間のチャネルを開きます。蠕動性ポンプ スイッチ 5 mL/分をすぐにガラス板を記入し、泡ゲルを入力するを許可しません。チューブにゲルがないときは、針を抜きます。 優しく dH2O を保つ重合のために少なくとも 1 時間室温でゲル ゲルをオーバーレイします。 ゲルを注入後すぐにチューブを洗浄によって dH2O でグラデーションの部屋を充填し、最大速度で蠕動ポンプを使用して。2、多くのゲルを準備しているときの間システム常に清潔します。 ゲルのバッファー x 3 の 3 mL を混合することによって 1 x ゲルのバッファーを準備し、優しくろ紙をゲルの表面から dH2O を削除 dH2O の 6 mL を追加します。ゲルのバッファー x 1 とゲルの表面を洗います。優しくろ紙をゲル バッファー × 1 を削除します。 ゲルのフィルター ペーパーからの繊維は避けてください。そのためには、一個に、はさみで紙を切って、紙の涙をしません。 ガラス プレートの間櫛が櫛の下でスタッキングのゲルを注ぐことができる完全に入れないでください。スタッキングのゲル (表 2) 4% を準備します。TEMED と AP を追加最後に彼らは簡単に重合を開始します。軽く回避の空気の泡を混ぜます。 櫛の下で泡を避け、スタッキングのゲルをオーバーレイし、櫛を完全に浸します。Let スタッキングのゲル重合櫛を取除き、ピペットを使用してゲル バッファー x 1 と井戸を洗浄する少なくとも 30 分のため。 重合後ゲルは +4 ° C で数日間保存できます。DH2O およびプラスチックを浸した紙で包んでゲルにゲルを保存フィルム、ゲルの乾燥を防ぐ。 4. ブルー ネイティブ電気泳 注: OXPHOS の劣化を防ぐために複合体を実行電気泳動 +4 ° C で中古冷蔵バッファーを使用します。 井戸の底まで青い陰極バッファーのゲル カセットをロードします。サンプルの読み込みは、カセットがない上にいっぱいになる簡単です。青い陰極バッファーと井戸を洗い、ピペットを使用して青い陰極バッファーで井戸を埋めます。 井戸にサンプル (蛋白質の 5-30 μ g) をロードします。優しく青い陰極バッファーと陽極バッファーとタンク上部にゲル カセットを入力します。 40 V の定電圧で 15 分のためのゲルを実行します。80 V に電圧を増やして (6 の定電流を使用してまたは mA)、10 を超えないように mA。染料 2/3 ゲルの長さに達するまでは、ゲルを実行します。 陰極バッファーと青い陰極バッファーを交換し、色素フロントがなくなるまで電気泳動を続けます。合計では、電気泳動は約 3 時間かかります。 ガラス板を取得し、半乾燥しみが付くことにより、ポリフッ化ビニリデン (PVDF) 膜に蛋白質を転送します。定電圧 25 V ・電流 1.0 A で 30 分間に制限を使用します。 また、濡れたしみが付くことを使用して OXPHOS 錯体を PVDF 膜に転送。 標準的な免疫ブロット プロトコルに従って膜と抗体の孵化のブロックに進みます。OXPHOS 複合体のサブユニットに対して一次抗体を順番に使用します。注: たとえば、複雑な抗 NDUFA9 抗体 (配分) を使用して私は、抗 UQCRC2 抗体 (1: 1000) 複合体 III、複合体 IV および抗 ATP5A 抗体 (配分) 複雑な V のための反 COX1 抗体 (配分) の複合体 II のアンチ SDHA 抗体 (配分)。抗体のリストは、テーブルの材料にされます。