Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung
Summary
Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut – Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.
Abstract
Die neurovaskuläre Einheit (NVU) besteht aus mikrovaskuläre Endothelzellen bilden die Blut – Hirn-Schranke (BBB), einer endothelialen Basalmembran mit eingebetteten Perizyten und die Glia Limitans komponiert von parenchymatösen Basalmembran und astrocytic Ende-Feed den abluminalen Aspekt des zentralen Nervensystems (ZNS) Mikrogefäßen umarmen. Neben der Aufrechterhaltung CNS steuert Homöostase der NVU Immunzelle Menschenhandel in das ZNS. Während der Tumorüberwachung des ZNS können niedrige Anzahl von aktivierten Lymphozyten die endotheliale Barriere überqueren, ohne BBB Dysfunktion oder klinische Krankheit zu verursachen. Im Gegensatz dazu kann bei Neuroinflammation wie z. B. Multiple Sklerose oder seine Tiermodell experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) eine große Anzahl von Immunzellen die BBB und anschließend die Glia Limitans erreicht schließlich die CNS Parenchym durchqueren zum klinischen Erkrankung. Immunzelle Migration in das CNS-Parenchym ist somit ein zweistufiger Prozess, der eine sequentielle Migration über die Endothelzellen und glialen Barriere der NVU beschäftigt verschiedene molekulare Mechanismen beinhaltet. Wenn ihre Passage über die endotheliale Barriere, T-Zellen begegnen ihr cognate Antigen auf perivaskuläre Antigen-präsentierenden Zellen ihre lokale Reaktivierung löst weitere Mechanismen, die die fokale Aktivierung des Gelatinases, die die T-Zellen, die Glia-Schranke, und geben die CNS Parenchym ermöglicht. So erlaubt die Bewertung BBB Permeabilität sowohl MMP-Aktivität in räumliche Korrelation zu Immunzelle Akkumulation im ZNS bei EAE Verlust der Integrität der Endothelzellen und glialen Barrieren der NVU angeben. Wir zeigen hier wie induzieren EAE bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung und anschließend BBB Permeabilität in-vivo mit einer Kombination von exogenen Fluoreszenz Tracer analysieren. Weiter zeigen wir, wie zu visualisieren und Gelatinase Aktivität in EAE Gehirnen von in-situ Zymogaphy gekoppelt an immunofluorescent Färbungen von BBB Keller Membranen und CD45 + eindringenden Immunzellen zu lokalisieren.
Introduction
Das zentrale Nervensystem (ZNS) koordiniert alle Körper und geistige Funktionen bei Wirbeltieren und CNS Homöostase ist essentiell für eine ordnungsgemäße Kommunikation von Nervenzellen. CNS-Homöostase ist gerechtfertigt durch die neurovaskuläre Einheit (NVU), schützt das ZNS aus dem veränderten Milieu den Blutstrom. Die NVU besteht aus CNS mikrovaskuläre Endothelzellen, die biochemisch einzigartig und die Blut – Hirn-Schranke (BBB) in kontinuierlichen Übersprechen mit Perizyten, Astrozyten und Neuronen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) zu etablieren, über zwei ausgeprägte Keller Membranen1. Der endothelialen Basalmembran, Ensheathes der abluminalen Aspekt der BBB Endothelzellen birgt eine hohe Anzahl von Perizyten und besteht aus Laminin α4 und Laminin α5, neben anderen ECM-Proteine-2. Im Gegensatz dazu der parenchymatösen Basalmembran besteht aus Laminin α1 und α2 Laminin und ist umgeben von astrocytic Ende-Füße. Die parenchymatösen Basalmembran zusammen mit den Astrozyten Ende-Füßen komponiert die Glia Limitans, die das CNS neuronale Netz aus dem Liquor cerebrospinalis gefüllt perivaskuläre oder Subarachnoidalraum Räume3segregiert. Durch die einzigartige Architektur der NVU unterscheidet sich Immunzellen in das ZNS Menschenhandel aus, dass in peripheren Geweben da es einen zweistufiger Prozess mit den Immunzellen erfordert, zuerst die endotheliale BBB und anschließend die Glia Limitans zur Verletzung Das CNS-Parenchym zu erreichen.
Multiple Sklerose (MS) ist eine häufige schwere Erkrankung des ZNS, in denen eine große Anzahl der zirkulierenden Immunzellen geben Sie die CNS und Neuroinflammation, Demyelinisierung und fokal Verlust von BBB Integrität4verursachen. Verlust der Integrität der BBB ist eine frühe Markenzeichen von MS, wie durch die Anwesenheit von Gadolinium Kontrast Verbesserung der Läsionen im ZNS als visualisierte durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)5angezeigt. Leukozyte Extravasation in das ZNS tritt auf der Ebene der postcapillary Venolen; Allerdings bleiben die genauen Mechanismen beteiligt Immunzelle Diapedese der BBB Basalmembran und anschließend die glialen Barriere um erkundet zu werden. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell für MS und hat maßgeblich zu unserem aktuellen Wissen über die Pathogenese der MS. Zum Beispiel wurde mit dem EAE-Modell entdeckt, dass Leukozyte Extravasation in einem mehrstufigen Prozess erfolgt, wie z. B. eine anfängliche Capture und Rollen Schritt durch Selectins und Mucin-ähnliche Moleküle wie z. B. P-Selektin Glykoprotein Liganden (PSGL) -1 vermittelt, gefolgt von Integrin-abhängige feste Verhaftung und kriechen von T-Zellen auf BBB Endothelzellen zu freizügigen Seiten für Diapedese6.
Wenn T-Zellen die endotheliale BBB und der endothelialen Basalmembran überquert haben, müssen sie ihre cognate Antigen auf Makrophagen oder dendritischen Zellen strategisch lokalisiert in den Leptomeningeal oder perivaskuläre Räumen begegnen. Diese Interaktion induziert Schwerpunkt Produktion von Pro-inflammatorischen Mediatoren diesen Auslöser die folgenden Mechanismen für CNS-Gewebe-Invasion von Immunzellen über die Glia Limitans7,8,9erforderlich. Fokale Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -2 und MMP-9 ändert Chemokin Aktivierung und induziert Abbau der extrazellulären Matrix Rezeptoren auf Astrozyten Ende-Füße, eine Voraussetzung für Immune Zelle Migration über die Glia Limitans in der CNS Parenchym und Beginn der klinischen Symptome von EAE10,11zu induzieren.
Kombiniert Erkennung des ZNS infiltrieren Immunzelle mit BBB liefert Leckage und Gelatinase Tätigkeit in CNS Gewebeschnitten wertvolle Informationen über die Funktionsfähigkeit der Endothelzellen und glialen Barriere im Rahmen des Neuroinflammation. Zum Beispiel haben wir vor kurzem untersucht den konstitutiven Verlust der endothelialen tight Junction Molekül Knoten Adhäsionsmolekül (JAM)-B Menschenhandel Immunzellen in das ZNS im Zusammenhang mit EAE. Im Vergleich zu gesunden Wildtyp C57BL/6 Mäusen, gesunde Marmelade-B-defizienten Wurfgeschwistern zeigte keine Beeinträchtigung der BBB Integrität über endogene als auch exogene Tracer12Durchlässigkeit in-vivo-Tests belegen. Im Rahmen der EAE JAM-B-defizienten C57BL/6 Mäusen zeigte verbesserte Krankheitssymptome, die wurde im Zusammenhang mit entzündlichen Zelle Überfüllung in den Leptomeningeal und perivaskuläre Räume12. Dieses Phänomen untersuchen wir zugewiesen in Situ Zymography zur Identifizierung von Gelatinase Aktivität um zu testen, ob mangelnde Gelatinase Aktivität in den JAM-B-defizienten Mäusen möglicherweise verantwortlich für die reduzierte Zahl der Immunzellen in der Lage zu durchbrechen die Glia Limitans12.
Angesichts der Verfügbarkeit von veränderten verschiedenen gentechnisch Maus Modelle fehlen, z. B. verschiedene BBB tight Junction-Moleküle, die Änderungen in der BBB-Funktion verursachen könnten Methoden für die Untersuchung von BBB Integrität wichtig sind. Darüber hinaus könnte neu entwickelte Medikamente auf NVU Barrieren auswirken. Hier zeigen wir wie bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) induzieren EAE-Peptid aa35-55 in komplette Freund Adjuvantien. Wir erklären dann wie Immunzelle Infiltration über die NVU Endothelzellen und glialen Barrieren hinweg zu lokalisieren und in-vivo Endothelzellen und glialen Barriereintegrität durch in-situ Detektion von exogenen Tracer und Gelatinase Aktivität, bzw. zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll überwachen EAE in weiblichen C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Frauen werden bevorzugt ausgewählt, und es gibt eine Inzidenz von Frauen: Männer 3:1 im MS. Zur Beurteilung der Schwere der EAE, wir haben eine 3-Punkt-Wertungsblatt nutzen. EAE Schweregrad wird in der Regel in Bezug auf den Schweregrad der motorischen Funktionsstörungen bewertet. Mäuse mit fortgeschrittenen Stadien der EAE, d.h. ausstellen eine Punktzahl über 2 geopfert werden sollte, um unnötiges Leiden der Tie…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen dankbar Lydia Sorokin, die ihre ursprüngliche in Situ Zymography Protokoll10 mit uns geteilt hat.
Materials
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
Referências
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