カエノラブディティス ・ エレガンスにおけるドーパミン伝達を評価するスイミング麻痺
Summary
スイミングによる麻痺 (SWIP) は確立された行動アッセイ ドーパミン線虫(C. elegans) におけるシグナル伝達の基本的なメカニズムを研究するために使用します。しかし、分析を実行する詳細な方法が欠けています。ここでは、SWIP のステップバイ ステップのプロトコルについて述べる。
Abstract
このプロトコルで記述されているスイミング アッセイは、シナプスのドーパミンを調整する蛋白質を識別するために有効なツールです。哺乳類と同様に、ドーパミン (DA) はc. の elegans学習や運動の活動を含むいくつかの機能を制御します。DA リリース (アンフェタミン (AMPH) 治療など) を刺激するまたは DA クリアランスを防止する条件 (DA トランスポータを欠けている動物など (dat 1)をニューロンに DA を reaccumulating ことができません) 細胞外 DA の過剰生成最終的に抑制した歩行運動の結果。この動作は、動物は、水中で泳ぐときに特に顕著です。実際には、野生の種類の動物は、長時間泳ぎ続ける、 dat 1 null 変異体と野生型 AMPH で扱われてまたは DA トランスポーターの阻害剤は井戸の底に沈むし、移動しないでください。この現象は、「スイミングによる麻痺」(SWIP) と呼ばれます。SWIP アッセイは十分に確立されたが、法の詳細な説明が欠けています。ここでは、我々 は SWIP を実行するステップバイ ステップ ガイドをについて説明します。アッセイを行う後期幼生段階 4 動物はコントロール ショ糖液 AMPH の有無を含むガラス スポットに配置されます。動物は、株分け業の堅実で可視化によって手動でまたは自動的にカメラで記録することによってマウントの遊泳行動を獲得しています。動画では、スラッシング周波数とヒート マップの形で麻痺の視覚的表現を生成の追跡ソフトウェアを使用しては分析しています。手動および自動の両方のシステムは動物の遊泳能力の簡単に定量化可能な読み出しを保証し、したがってベアリング ドパミン神経系内の変異動物または補助遺伝子スクリーニングを促進します。また、SWIP は AMPH など乱用薬物の作用の機構を解明する使用ことができます。
Introduction
動物は、さまざまな複雑なシグナリング プロセスによって調整される別の神経伝達物質によって仲介される生得的で複雑な動作を実行します。神経伝達物質ドーパミン (DA) は、学習、運動機能と報酬の処理を含む種を渡って非常に節約された行動を仲介します。
交尾、学習、採餌、運動、産卵など DA によって規制されている多くを含む著しく複雑な動作を示しますのみ 302 ニューロンから成る比較的シンプルでもマップされた神経系と土壌線虫C. elegans、1。 その他の機能、短いライフ サイクルと扱いやすさ、シグナル分子の保全、の中で保存された行動の神経基盤を研究するためのモデルとして線虫を使用する利点を強調表示します。
両性具有者c. の elegansを含む 8 つのドーパミン作動性ニューロン。これらに加えて、雄には交尾目的の六つの追加のペアが含まれます。これらのニューロンは、哺乳類のように DA を合成し、DA トランスポーター (DAT 1)、DA ドーパミン作動性ニューロンにシナプス間隙で解放を輸送するドーパミン作動性ニューロン、排他的に見られる膜蛋白質を表現します。また、合成、包装と DA のリリースの各ステップに関与するタンパク質のほとんどはワームと人間の非常に節約されるのような哺乳類で、DA を調節する給餌行動と線虫2歩行。
線虫は、固体表面上をクロールし、水中における特徴的なスラッシング挙動で泳ぐ。興味深いことに、DAT 1 (dat 1) の表現に欠けている突然変異体は通常固体表面上のクロールが水に漬してスイミングを維持するために失敗します。この現象は、スイミングによる麻痺、あるいは SWIP に名付けられました。前の実験は SWIP が一部では、最終的に overstimulates D2 のようなシナプス後受容体 (DOP 3) シナプス間隙に DA の過剰によって引き起こされることを示した。もともと、 dat 1ノックアウト動物3で同定されたが SWIP で DAT (例えば、イミプラミン4) の妨害活動する薬と扱われる野生型動物観察もや DA リリース (例えば、アンフェタミン5) を誘発します。その一方で、薬理学的または遺伝的操作ダの合成と放出を回避と DOP 3 受容体機能のブロックは SWIP6を防止します。一緒に取られて、これらの既にパブリッシュされたデータがドーパミン作動性シナプス3,4,7内変異蛋白質によって引き起こされる行動への影響を検討し、採用の信頼性の高いツールとして SWIP を確立しています。DA7,8,9,10、11,12をシグナル伝達に関与する新規規制経路を識別するための遺伝的画面に転送します。さらに、生きている動物の行動の薬剤誘発性の容易に定量化可能な読み出しを提供することにより SWIP アンフェタミン (AMPH) のような薬剤の作用機序の解明できアザペロン、ドーパミン作動性のシナプス5,6,13,14,15。
SWIP の試金を実行するプロトコルは、16の前に記載されています。ここでは、方法論と SWIP を効果的に実行するc. の elegansのコミュニティのための視覚的なガイドを提供することを目標に分析を実行するセットアップ詳細に述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、線虫の行動分析、SWIP を実行するステップバイ ステップ プロトコルについて述べる。このプロトコルはないの主要な技術的なハードルがこの試金非常にユーザーがフレンドリーなこと、シンプルでわかりやすいです。それにもかかわらず、分析を効果的に実行するために考慮すべきいくつかの重要な側面があります。
食餌療法の制限に影響を与える SWI…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、SWIP の自動分析と指導の博士ランディ ブレイクリー ラボから博士オサマ Refai を感謝したいです。この作品は、LC に NIH R01 DA042156 からの資金によって支えられました。
Materials
| Aluminum foil | Reynolds wrap | 1091835 | |
| Amphetamine | Sigma | 51-63-8 | |
| Autoclave | |||
| Bacterial Incubator | New Brunswick scientific | M1352-0000 | |
| Bacteriological grade, Agar | Lab Scientific, Inc | A466 | |
| Bacto (TM) Peptone | BD | REF 211677 | |
| Calcium Chloride (dihydrate) | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Camera | Thorlabs | U-CMAD3 | |
| Centrifuge | Eppendorf 5810R 15amp | E215059 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | |
| Deionised water | Millipore | Z00QSV0WW | Milli-Q |
| Depression glass spot plate | Corning | Corning, Inc. 722085 | |
| Erlenmeyer flask | ThermoFisher | 4103-0250PK | |
| Eye lash | |||
| Glass slide | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Graphing and statistical software | Prism | Graphpad 5 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | RB=H3375 & H7006 | |
| Hypochlorite | Hawkins | Sodium Hypochlorite 4-6%, USP" 1 gal | |
| LB Broth, Miller | Fisher | BP1426 | |
| Magnesium Chloride (Hexahydrate) | Sigma-Aldrich | RB=M0250 | 500g |
| Magnesium sulfate (heptahydrate) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| Magnetic stir bar | Fisherbrand | 16-800-510 | |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | 69715 | |
| NA 22 bacteria | CGC | ||
| Nystatin | Sigma | 1400-61-9 | |
| Osmometer | Advanced Instruments, Inc | Model 3320 | |
| Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Petriplates | Falcon | 351007 | |
| pH Meter | Orion VersaStar Pro | IS-68X591202-B 0514 | |
| Polystrine conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Potassium Phosphate – DIBASIC | Sigma-Aldrich | P-8281 | |
| Potassium Phosphate – MONOBASIC | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Serological pipettes | VWR | 10ml=89130-898 | |
| Shaker | Reliable Scientific | 55S 12×16 | |
| Sodium Chloride | Fisher | RB=BP358-1 | |
| Sodium dihydrogen Phosphate | Fisher | RB=S381 | |
| Spreadsheet | MS office | Microsoft Excel | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Model tlb3. 1 stemi2000 | |
| Sterile Pipette tips | Various | 02-707-400 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | RB=S5016 | |
| Superglue | Loctite | 1647358 .14 oz. | |
| SwimR sofware | 10.18129/B9.bioc.SwimR | ||
| Tracker 2 | Worm Tracker 2.0 | www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/ | |
| Video recording software | Virtualdub | http://www.virtualdub.org/ |
Referências
- de Bono, M., Villu Maricq, A. Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans. Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).
- Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway. Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).
- McDonald, P. W., et al. Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1. Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).
- Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192 (2008).
- Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans. Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).
- Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. Neurochemistry International. , (2018).
- Bermingham, D. P., et al. The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).
- Nass, R., et al. A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking. Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).
- Hardaway, J. A., et al. Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis. G3. 2 (8), 961-975 (2012).
- Hardaway, J. A., et al. Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling. Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).
- Felton, C. M., Johnson, C. M. Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels. G3. 4 (6), 1081-1089 (2014).
- Lanzo, A., et al. Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans. Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).
- Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans. The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).
- Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel. Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).
- Carvelli, L. Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel. Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).
- Hardaway, J. A., et al. et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis. Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).
- Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -. C., Döring, F. Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental Biology. 217, 2480-2488 (2014).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).
- Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -. L., Holmes, A., Gartner, A. Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans. PLoS Genetics. 10 (12), 1004767 (2014).
- Jayanthi, L. D., et al. The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter. Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).
