이 프로토콜은 살아있는 동물 또는 향상 된 락 진압 및 tet 활성 시스템을 사용 하 여 셀에 있는 관심사의 내 생 유전자의 녹음 방송을 통제 될 수 있다 조건에 따라 모델 시스템을 생성 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다.
우리가 되돌릴 수 및 가변 식 제어할 수 있는 원격 제어 시스템 (다시versible Manipulation of Transcription Endogenous loci에서), 구현에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기는 생활의 내 생 유전자 시스템 모델. 원격 제어 시스템 다운-또는 단일 생물 학적 시스템 내에서 대상 유전자의 upregulation를 달성 하기 위해 향상 된 락 억제와 tet 활성화 시스템을 사용 합니다. 꽉 억압 유연 하 게 위치한 사이트 바인딩 진압에서 달성 될 수 있다 녹음 방송 신장 억제 함으로써 녹음 방송 시작 위치의 하류까지. 강력한 upregulation 동족 발기인에 tet transcriptional 활성 제를 대상으로 내 생 유전자의 전사를 강화 하 여 달성 될 수 있다. 이 가역 및 가변 식 컨트롤 적용 하 고 유기 체에서 반복적으로 철수 수 있습니다. 힘과 같이 내 인 성 Dnmt1 , 여기에 대 한 시스템의 다양성을 허용할 것 이다 더 정확한 생체 조건 기능적인 분석 다양 한 식 수준에서 유전자 기능의 조사 함으로써 고의 반전 기능을 테스트 하 여는 표현 형입니다.
유전자 녹아웃 또는 유전자 변형 접근 동물 모델에서 유전자 기능을 연구 하는 효과적인 수단 되었습니다. 그러나, 이러한 방법에의 한 식 규제 dichotomous (온/오프), 비 시간적, 이며 따라서 유전자의 완전 한 기능 스펙트럼을 드러내는 능력입니다. Spatio 시간적 비활성화 또는 활성화 유전자 함수, 조건부 Cre/LoxP 기술 허용 하지만 그들의 둘로 나눠진 본성 포즈 셀 치 및 경험 irreversibility1,2 등 한계를 계속 , 3.이 공 허를 채우기 위해 조건부 최저의 방법을 개발 되었으며 tet를 사용 하 여-shRNA 또는 미르4규제. 그러나, 오프 대상 효과 RNAi5 에 대 한 관심사를 유지 하 고 도전 vivo에서. 을 제어 하 더 최근에, CRISPR/Ca 중재 transcriptional 통제는 업 및 내 인 성 유전자 발현의 downregulation를 달성 하는 더 다양 한 접근법을 도입 기술과 그들의 유틸리티6,7 시연 . 그러나, transcriptional 제어 CRISPR/Ca 중재의 효과 아직 vivo에서 명확 하지 않다 고 리아 기반 억압의 가역 리아에 의해 본, 강한 억압 하 남아 있고 그것의 상호 작용 단백질 KAP1 유도 표시 되었습니다. 영구적인 유전자 침묵8,9.
이러한 한계를 해결 하기 위해 우리 소설 transcriptional 규제 시스템은 조건부로 제어는 가역에 내 인 성 유전자 발현의 수를 개발 하 고 마우스를 사용 하 여 조정할 수 있는 방식으로 간결한 이진 transcriptional 설계 규제 시스템10. 락 등 tet, 규제 ligands와 간결한 이진 transcriptional 규제 시스템 같은 가역 활성화 및 가변 식 제어11,12,13, 그러나 14., 현재 이진 시스템의 부적당 한 진압 힘 포유류에 내 인 성 유전자 발현을 제어 하기 위한 그들의 광범위 한 채택에 장애가 있다. 우리는 충분히 내 생 유전자의 진압에 대 한 강력한 향상 된 락 억압 시스템 개발 하 고 달성 하기 위해 내 생 유전자의 동족 발기인에 직접 tet transcriptional 활성 제를 대상으로의 새로운 전략을 채택 강력한 upregulation (그림 1)10. 이 기술로, 우리 가락, 유도할 수 있는, 그리고 가역 방식으로10내 생 Dnmt1 유전자의 거의 두 배나 식 제어를 달성 했다. 여기 우리는 다른 유전자와 마우스를 사용 하 여 모델 종으로 생물을 vivo에서 응용 프로그램에 대 한 단계별 지침을 제공 합니다.
그림 1 : 원격 제어 시스템의 개요. 내 생 대상 유전자의 전사는 설계 lac 진압 tet 활성 시스템을 사용 하 여 조정할 수 있습니다. 대상 유전자 발기인 또는 intron 꽉 바인딩 LacIGY 진압 및 rt에 대 한 연산자를 포함 하는 설계 조교 M2 활성 제. R Repron (담당자ression 하루에에), 부분 토끼 beta globin intron 플러스 12 대칭 락 연산자 (S)를 포함 된 나타냅니다. T는 tet 연산자를 나타냅니다. 진압 또는 활성 제/조직 관련 발기인에서 표현 됩니다. 대상 유전자의 표현 수 있습니다 다음 역 조정 된 원하는 식 수준으로 IPTG (이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY 진압의 길 항 제) 또는 Doxycycline (Dox)의 관리에 의해. 이 그림 리 외.10에서 수정 된이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 프로토콜을 시작 하기 전에 표 1 유전자 발현의 원하는 컨트롤 관련 단계를 식별 하는 검토. 예를 들어 “X 유전자”의 가역 downregulation를 가능 하 게 마우스를, 섹션 1, 3, 및 4의 완료는 프로토콜 아래. 표 1 은 또한 원격 제어 시스템의 필요한 구성 요소를 요약합니다.
원하는 식 변화 | 억압만 | 활성화만 | 억제 및 활성화 |
프로토콜의 관련 섹션 | 1, 3-4 | 2-4 | 1-4 |
대상 유전자에 필요한 원격 제어 시퀀스 | Repron (“억압 intron”; 12 대칭 락 연산자와 부분 토끼 beta globin intron) | Tet operator(s) | Repron와 Tet operator(s) |
원격 제어 시퀀스 위치 | Intron | 발기인 | Intron 및 발기인 |
활성 제/진압 원하는 제어에 필요한 | LacIGY 진압 | rtTA M2 활성 제 | LacIGY 진압 및 rtTA M2 활성 제 |
규제 Ligands | IPTG | Doxycycline | IPTG 또는 Doxycycline |
표 1: 원격 제어 구성 요소 개요.
중요 한 단계 및 원격 제어 시스템의 잠재적인 제한 대상 유전자 발현에 영향을 주지 않고 진압 활성 바인딩 사이트의 삽입과 관련 된 도전 이다. 우리의 원래 억압 접근 Dnmt1 유전자에 적용 한 대로 삽입 발기인의 transcriptionally 중요 한 지역 내의 락 진압 바인딩 사이트의 참여. 발기인 기능에 영향을 미치는 이렇게 위험을 줄이기 위해 원격 제어 시스템의 일반적인 적용 개선, 우리는 억압 intron 기반 접근 방식을 개발. 우리의 향상 된 락 시스템의 힘 단단히 우리 연산자 위치에서 테스트 하는 모든 강한 발기인의 녹음을 억 누르다 수 수백 전사의 여러 kilobases 하류 시작 사이트 (그림 3A-C) 10. 중요 한 것은, 억압의 레벨 발기인 (그림 3A-C)10의 transcriptional 강점의 독립 했다. 이 우리의 억압 intron 기반 시스템의 억압 용량 초과 테스트 발기인의 transcriptional 강도 나왔다. 이 intron 기반 접근에 그것 억압은 두 가지 구성 요소, 녹음 방송 신장 기계와 락 repressors57사이 물리적 간섭을 통해 중재 높습니다. 이 간단한 억압 메커니즘 및 intron 기반 방법의 검증 된 견고성 렌더링 수 있습니다이 이렇게 다른 유전자, 조직, 및 유기 체에 일반적으로 적용 가능한.
원격 제어 시스템에 의해 upregulation 발기인 기능에 영향을 미치는의 위험을 수 반하는 대상 유전자 발기인에 근접에 있을 transactivator 바인딩 시퀀스를 필요 합니다. 그러나, 우리는 바인딩 시퀀스 위치 transcriptionally 중요 영역 바깥에 있을 수 있습니다 발견. Dnmt1 및 EF1α 발기인 튼튼하게 upregulated tet 연산자에서 몇 백 기초 상류 녹음 방송 시작 사이트10의 위치 했다. 이 편안한 제약은 크게는 transactivator의 부재에서 대상 유전자의 발기인 기능에 영향을 미치는의 위험을 줄여줍니다. 시퀀스의 바인딩 수를 증가 하거나 강한 transactivators의 사용 더 멀리 녹음 시작 사이트 사이트에서 upregulation 함으로써 위험을 줄일 수 합니다.
우리의 원격 제어 시스템은 우아한 제어 수준, 타이밍, 및 내 생 유전자 발현, 테스트는 표현 형의 반전 기능 및 다른 식 수준에 의해 쉽게 달성 되지 않은 결과 대 한 수의 위치 현재 생체 조건 유전자 식 제어 기술입니다. 우리를 포함 한 대부분 유전자 표정 분석 식 값 중 상당한 변이가 있습니다 셀의 모집단의 평균을 나타내는 중요 하다. 이 분화 또는 apoptosis58등 세포 의사 결정 프로세스에 영향을 미칠 수 있습니다. 진 식 제어의 정밀도 가능성이 향상 될 수 더 추가 유전자 회로 엔지니어링59, 비록 우리의 현재 시스템의 관찰된 힘 많은 생물학 문맥에서 유전자 기능의 유용한 조사를 허용할 것 이다. 또한, 대상 특이성의 고차 연산자 시퀀스 뿐만 아니라 포유류와 규제 구성 요소60의 원래 종 사이의 큰 진화 거리의 복잡성 때문에 예상 된다. 또한, repressors의 활성 유전자 변형 마우스 라인 개발 하 고 어떤 내 생 유전자에 대 한 고용 될 수 있습니다. 예를 들어 기존 tet transactivator 마우스 모델에서 원하는 마우스 조직 대상 유전자의 upregulation를 달성 하기 위해 적응 될 수 있다. 우리는 최근 여러 조직 유형 Hipp11 소재 시48에 lacIGY 유전자를 도입 하 여 기존 Cre 라인와 결합 될 때에 우리의 향상 된 락 진압의 강력한 조직 관련 표현 구동할 수 유전자 변형 라인 개발 Lox-정지-Lox 요소 (미 출판)의 통제. 이 라인 것 실질적으로 원격 제어 시스템의 조직-특정 응용 프로그램을 촉진 한다.
원격 제어 시스템에 의해 유전자 upregulation 현재 유도할 수 있는 유전자 변형 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그것은 그것은 활용 내 생 로커 스 선의 여러 유전자 변형, 삽입의 위치 효과 대 한 테스트 생성이 필요 하지 않습니다. 또한,이 방식은 강한 초기 식으로 유전자의 upregulation 적합 이미 강력한 발기인에서 향상 하기 때문에 기존의 유전자 변형 모델 최소한의 바이러스 성 발기인에 의존 하는 반면. 마지막으로, 조직 특이성, 세포 주기 제어 및 대상 유전자의 이체를 접합 수 있습니다 유지 upregulation에 우리의 접근 방식에 의해 타고 난 cis등 자연의 요소를 유지로-규제 요소. CRISPR/Ca-중재 하는 유전자를 대상으로 기술의 출현 크게 다양 한 모델 시스템에서이 기술의 응용 프로그램을 촉진 한다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 늦은 박사 하 이디 Scrable (메이 요 클리닉, 로체스터, 미네소타), 포유류 lacI 유전자 구성의 그녀의 관대 한 선물에 대 한 감사 Villin 발기인을 제공 하기 위한 박사 다니엘 Louvard (인 퀴리, 파리, 프랑스) 및 박사로 리 잭슨-Grusby (어린이 병원, 보스턴, MA)이 기술 개발의 초기 단계에 그녀의 기여 금을 위해. 우리는 그들의 지원을 생성 하는 유전자 변형 및 녹아웃 쥐에 대 한 박사 낸시 우와 박사 로버트 Maxson 감사입니다. 우리 유용한 토론 레어 실험실의 구성원 감사 하 고 지원 합니다. 이 작품은 건강의 국가 학회 [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918, 및 P.W.L. R01 CA212374와 N.A.V.S에 1F31CA213897-01A1]에 의해 지원 되었다.
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