هذا البروتوكول يحدد الخطوات اللازمة لإنشاء نظام نموذجي الذي النسخ من الجينات الذاتية لمصلحة يمكن التحكم في شروط في الحيوانات الحية أو الخلايا باستخدام قامع المحسن أمريكا اللاتينية والكاريبي و/أو نظم المنشط تيت .
هنا يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نظام التحكم عن بعد (إعادةفيرسيبلي مأنيبوليشن سو تيرانسكريبشن في هندوجينوس المكاني)، الذي يسمح للسيطرة على التعبير عكسها والانضباطي نموذج الجينات الذاتية للاهتمام بالمعيشة النظم. نظام التحكم عن بعد تستخدم أنظمة التنشيط القمع و تيت المحسن لاك تحقيقا لأسفل أو upregulation من الجينات المستهدفة داخل نظام بيولوجي واحد. القمع ضيق يمكن أن يتحقق من قامع ملزم مواقع مرونة يقع المصب من موقع بدء النسخ عن طريق تثبيط استطالة النسخ. أوبريجولاتيون قوية لا يمكن تحقيقه بتعزيز النسخ من الجينات الذاتية باستهداف تيت المنشط النسخي للمروج المشابهة. ويمكن تطبيق عنصر التحكم هذا التعبير عكسها والانضباطي وسحبت مرارا وتكرارا في الكائنات الحية. بفاعلية وبراعة للنظام، كما هو موضح للذاتية Dnmt1 هنا، سوف تسمح أدق التحليلات الفنية المجراة في تمكين تحقيق وظيفة الجينات التعبير على مختلف المستويات والتجارب إمكانية الرجوع من النمط الظاهري.
خروج المغلوب الوراثية أو النهج المعدلة وراثيا كانت وسيلة فعالة لدراسة وظيفة الجينات في نماذج حيوانية. ومع ذلك، تنظيم التعبير بهذه النهج التفرع (تشغيل/إيقاف)، غير الزمان، وبالتالي غير قادر على الكشف عن الطيف الكامل من الجينات الوظيفية. الشرطي Cre/لترأوكسب تكنولوجيات أتاحت المنظمة الزمانية أو تنشيط وظيفة الجينات، ولكن طبيعتها التفرع لا تزال تشكل القيود، مثل هلاك الخلية وعدم الرجعة1،2 , 3-من أجل ملء هذا الفراغ، وضعت نهوج ضربة قاضية الشرطي استخدام تيت-ينظم شرنا أو ميرنا4. بيد أن آثار خارج الهدف يظل مصدر قلق بالنسبة [رني]5 وقد تم الطعن في التحكم في الحية. في الآونة الأخيرة، قد قدم نهجاً أكثر تنوعاً لتحقيق كل من أعلى-و downregulation التعبير الجيني الذاتية كريسبر/Cas-بوساطة النسخي لمراقبة تكنولوجيات وأثبتت تلك المرافق6،7 . ولكن فعالية مراقبة النسخي كريسبر/Cas-بوساطة من غير الواضح حتى الآن في فيفو، وتظل إمكانية الرجوع للقمع على أساس KRAB أن ينظر إليها، كما قوي القمع من جانب KRAB وقد ثبت البروتين التفاعل KAP1 لحمل الدائمة الجينات إسكات8،9.
بغية معالجة أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير نظام تنظيمي النسخي رواية قادرة على السيطرة على شروط التعبير الجيني الذاتية في عكسها وطريقة الانضباطي في الفئران باستخدام هندسة النسخي بدائية ثنائي 10من اللوائح التنظيمية. بدائية الأنظمة التنظيمية النسخي ثنائي مع يغاندس التنظيمية، مثل أمريكا اللاتينية والكاريبي و تيت، وقد مكنت هذه عكسها والانضباطي التعبير التحكم11،،من1213، 14. ومع ذلك، أعاق فاعلية القمع عدم كفاية النظم الثنائية الحالية على اعتماد واسع النطاق للتحكم في التعبير الجيني الذاتية في الثدييات. ونحن وضعت نظام قمع لاك المحسن قوية بما فيه الكفاية لقمع الجينات الذاتية وتوظيف استراتيجية رواية استهداف تيت المنشط النسخي مباشرة إلى مروج المشابهة الجينات الذاتية لتحقيق 10من أوبريجوليشن قوية (الشكل 1). مع هذه التكنولوجيا، فقد حققنا تقريبا اثنين من حيث الحجم تحكم تعبير الجينات Dnmt1 الذاتية في طريقة الانضباطي، وإيندوسيبلي، وعكسها10. هنا يمكننا توفير إرشادات خطوة بخطوة لتطبيق المجراة في الجينات والكائنات باستخدام الفئران كأحد أنواع نموذجية الأخرى.
الشكل 1 : نظرة عامة على نظام التحكم عن بعد- يمكن أن تنظم النسخ من الجينات المستهدفة الذاتية استخدام قامع هندسيا أمريكا اللاتينية والكاريبي ونظم تيت المنشط. المروج الجينات المستهدفة أو إنترون هو إجراء هندسة عكسية لاحتواء المشغلين قامع لاسيجي ضيق الملزمة و/أو rtالمنشط تا-M2. R يشير إلى ريبرون (Repريثيون عنترعلى)، التي تحتوي على 12 لاك متماثل العوامل (S) بالإضافة إلى إنترون بيتا جلوبين أرنب جزئي. T تشير إلى المشغل تيت . قامع و/أو المنشط ويتم التعبير عنها من مروج الأنسجة على حدة. التعبير عن الجينات المستهدفة يمكن ثم عكسية ضبطها إلى المستوى المطلوب من التعبير بإدارة إيبتج (الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي، خصم من قامع لاسيجي) أو الدوكسيسيكلين (دوكس). وقد تم تعديل هذا الرقم من لي et al.10الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
قبل البدء بهذا البروتوكول، استعراض الجدول 1 تحديد الخطوات ذات الصلة لعنصر التحكم المطلوب من التعبير الجيني. على سبيل المثال، لمهندس ماوس تمكن downregulation عكسها للجينات “X”، أكمل المقاطع 1 و 3 و 4 من دون البروتوكول. ويلخص الجدول 1 أيضا المكونات اللازمة لنظام التحكم عن بعد.
تغيير التعبير المطلوب | القمع فقط | التنشيط فقط | القمع والتنشيط |
الفروع ذات الصلة من البروتوكول | 1، 3-4 | 2-4 | 1-4 |
تسلسل التحكم في الجينات المستهدفة | ريبرون (“إنترون القمع”؛ 12 لاك متماثل مشغلي زائد إنترون بيتا جلوبين أرنب جزئي) | منقولة تيت | منقولة ريبرون وتيت |
موقع تسلسل التحكم عن بعد | إنترون | مروج | إنترون & المروج |
المنشط/قامع اللازمة لعنصر التحكم المطلوب | قامع لاسيجي | منشط رتا-M2 | لاسيجي قامع والمنشط رتا-M2 |
يغاندس التنظيمية | إيبتج | الدوكسيسيكلين | إيبتج و/أو الدوكسيسيكلين |
الجدول 1: نظرة عامة على مكونات جهاز التحكم عن بعد.
الخطوة الحاسمة، والقيد المحتملة من نظام التحكم هو التحدي المرتبطة بالإدراج قامع و/أو مواقع ربط المنشط دون التأثير على الجينات المستهدفة. لدينا نهج القمع الأصلي، كما هو مطبق على الجينات Dnmt1 ، تشارك إدراج مواقع الربط قامع لاك داخل المناطق الحرجة ترانسكريبتيونالي من مروج. من أجل الحد من المخاطر التي تؤثر على وظيفة المروج ومن ثم تحسين التطبيق العام لنظام التحكم عن بعد، وقمنا بتطوير نهج القائم على إنترون قمع. فاعلية نظامنا المحسن لاك سمح لنا بأحكام قمع النسخ جميع المروجين القوى اختبرنا في مشغلي الموقع مئات إلى عدة كيلوبس المصب من النسخ بدء تشغيل مواقع (الشكل 3أ – ج) 10-الأهم من ذلك، كانت مستويات القمع مستقلة من مواطن قوة النسخي المروجين (الشكل 3أ – ج)10. وهذا يوحي بأن يتجاوز قدرة نظامنا على أساس إنترون القمع القمع القوام النسخي المروجين اختبارها. في هذا النهج القائم على إنترون، فمن المرجح أن القمع هو يتوسط من خلال التدخل المادي بين عنصرين واستطالة النسخ إليه و ريبريسورس في أمريكا اللاتينية والكاريبي57. هذه الآلية البسيطة القمع وأظهرت متانة الأسلوب القائم على إنترون، قد تجعل هذا النهج المطبقة عموما على جينات مختلفة، والأنسجة، والكائنات الحية.
أوبريجوليشن بنظام التحكم عن بعد يتطلب تسلسل الملزمة ترانساكتيفاتور لتكون على مقربة من المروج الجينات المستهدفة، التي تنطوي على خطر التأثير على وظيفة المروج. ومع ذلك، وجدنا أن موقف ملزم تسلسل يمكن أن تكون خارج المنطقة الحرجة ترانسكريبتيونالي. وكانت المروجين Dnmt1 و EF1α قوة upregulated من مشغلي تيت تقع بضع مئات القواعد المنبع ل مواقع بدء النسخ10. هذا القيد استرخاء يقلل كثيرا من فرصة التأثير على مروج وظيفة الجينات المستهدفة في غياب ترانساكتيفاتور. زيادة عدد ربط تسلسل و/أو استخدام ترانساكتيفاتورس أقوى يمكن أن يساعد على زيادة خفض الخطر عن طريق تمكين upregulation من مواقع بعيداً عن موقع بدء النسخ.
لدينا نظام التحكم عن بعد يوفر تحكم أنيقة مستوى وتوقيت وموقع التعبير الجيني الذاتية، مما يسمح لاختبار إمكانية الرجوع من النمط الظاهري والمترتبة على مستويات مختلفة من التعبير، التي لا يسهل تحقيقها الحالي في تكنولوجيات التحكم تعبير الجينات فيفو. من المهم ملاحظة أن قيم التعبير في معظم التحليلات التعبير الجيني، بما في ذلك بلدنا، يمثل متوسط عدد سكان خلايا بينها تباين كبير ويمكن الاطلاع على. قد يؤثر هذا التغاير الخلوية عمليات صنع القرار، مثل التفريق أو المبرمج58. على الرغم من أن يمكن المحتمل أن زيادة تحسين الدقة في التعبير الجيني التحكم بالدائرة الوراثية الإضافية هندسة59، لوحظت فاعلية نظامنا الحالي سيسمح التحقيق مفيدة لوظيفة الجينات في العديد من السياقات البيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، من المتوقع بدرجة عالية من الدقة المستهدفة بسبب تعقيد تسلسل عامل، فضلا عن المسافة تطورية كبيرة بين الثدييات والأنواع الأصلية من المكونات التنظيمية60. وعلاوة على ذلك، يمكن وضع خطوط الماوس المعدلة وراثيا ريبريسورس والمنشطات وتوظيفهم لأي الجينات الذاتية. على سبيل المثال، يمكن تكييفها مع نماذج الماوس ترانساكتيفاتور تيت الحالية لإنجاز upregulation الجينات المستهدفة في أنسجة الماوس المطلوب. ونحن مؤخرا بوضع خط المعدلة وراثيا التي يمكن أن تدفع قوي الأنسجة على حدة التعبير عن قامع لاك تعزيز جهودنا في العديد من أنواع الأنسجة عندما جنبا إلى جنب مع الخطوط العرقية القائمة بإدخال الجين لاسيجي في محور Hipp11 48 الخاضعة لسيطرة عنصر لوكس-توقف-لوكس (غير منشور). هذا الخط سيسهل إلى حد كبير تطبيق نظام التحكم عن بعد الخاصة بالانسجة.
أوبريجوليشن الجينات بنظام التحكم عن بعد يوفر العديد من المزايا مقارنة بالنهج الحالية المعدلة وراثيا إيندوسيبلي. أنها لا تتطلب جيل من عدة أسطر المحورة وراثيا لاختبار تأثيرات الموقف من الإدراج، كما أنه يستخدم محور الذاتية. بالإضافة إلى ذلك، هذا النهج مناسبة تماما ل upregulation جينات مع التعبير الأساس القوى لأنه يعزز التعبير من مروج الفعل قوية، بينما النماذج المعدلة وراثيا التقليدية تعتمد على الحد الأدنى من المروجين الفيروسية. وأخيراً، الأنسجة خصوصية ومراقبة دورة الخلية، وذو المتغيرات الجينات المستهدفة قد يكون الاحتفاظ عند upregulation من نهجنا، كما أنه يحافظ على عناصر التنظيم الطبيعي مثل الفطرية رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية. ظهور كريسبر/Cas-بوساطة تكنولوجيا الجينات استهداف سيسهل تطبيق هذه التكنولوجيا في نظم نموذجية متنوعة.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر الراحل الدكتور هايدي سكرابل لها هدية سخية لبناء الجينات ﻻسي الثدييات (كلينك، روتشستر، مينيسوتا)، الدكتور دانيال لوفارد (معهد كوري، باريس، فرنسا) لتوفير المروج بيلين، والدكتور لوري جاكسون-جروسبي (مستشفى للأطفال، بوسطن، ماجستير) لاسهاماتها في المراحل المبكرة من هذا التطور التكنولوجي. ونحن ممتنون للدكتورة نانسي وو، والدكتور روبرت ماكسسون لمساعدتها في توليد الفئران المحورة وراثيا والضربة القاضية. ونشكر أعضاء المختبر ليرد لإجراء مناقشات مفيدة ودعم. وأيد هذا العمل “المعاهد الوطنية للصحة” [R01 CA75090 R01 DA030325، R01 CA157918 و R01 CA212374 إلى P.W.L. و 1F31CA213897-01A1 إلى N.A.V.S].
B6C3F1/J | The Jackson Laboratory | 100010 | https://www.jax.org/strain/100010 |
Cas9 Protein | PNA Bio | CP04 | http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE |
CRISPOR | Haeussler et al. 2016 | http://crispor.tefor.net/ | |
Doxycycline-Containing Mouse Diet | Envigo | Varies by concentration | https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/ |
ENCODE Database | Stanford University | https://www.encodeproject.org/ | |
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) | Addgene | 65795 | https://www.addgene.org/65795/ |
IPTG | GoldBio | I2481C | https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg |
pGL3-Basic | Promega | E1751 | https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751 |
SVM-BPfinder | Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University | http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/ | |
TiProD: Tissue specific promoter Database | Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen | http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de | |
UCSC Genome Browser | University of California Santa Cruz | https://genome.ucsc.edu/ |