Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

Il cervello è separato dalla circolazione sistemica da una struttura non-permeabile che limita gli scambi tra parenchima del cervello e del sangue, chiamato emato – encefalica (BBB). Principalmente composto di cellule endoteliali cerebrali, la BBB dinamicamente interagisce con gli astrociti, microglia perivascolari e neuroni del parenchima cerebrale vicine. Le tre funzioni principali della BBB sono la creazione e il mantenimento dell’omeostasi ionica per funzioni neuronali, rifornimento del cervello con le sostanze nutrienti e protezione dalle lesioni tossiche o ingresso di agenti patogeni^1,2, che contribuiscono alla il mantenimento della omeostasi del cervello e sue funzioni³. Questa barriera è così efficiente che solo pochi farmaci possono attraversare la BBB,^4,5. Allo stato attuale, i metodi disponibili per predire se una molecola passa la BBB e diffuso nel cervello sono costituiti ex vivo studi sul monitoraggio di immagine materiale, autopsia del cervello di volontari umani di MRI (risonanza magnetica) o PET (emissione della posizione la tomografia) o farmacodinamica e farmacocinetici studi preclinici in animali^6,7,8. Queste tecniche e modelli hanno alcune limitazioni, come la risoluzione limitata dell’animale domestico e la bassa sensibilità di MRI^6,8, la difficoltà di quantificare molecole (cioè, le molecole dell’anticorpo basato per esempio) che male penetrare il cervello⁷e per il preclinici studia il loro costo elevato e la località di sperimentazione animale.

L’ultimo punto è importante perché, secondo il 3R regole, (sostituzione, affinamento e riduzione dei test sugli animali) le amministrazioni di regolamentazione hanno chiesto che i ricercatori sviluppano urgentemente scientificamente accurata alternativa all’animale sperimentazione^{9,10,11,12,13,14,15}.

Negli ultimi decenni, diversi modelli in vitro di BBB sono stati proposti^16,17,18 coltivando il filtro membrana inserisce le cellule endoteliali da diverse specie come il mouse, ratto, bovino e suino. Per quanto riguarda la specie umana, la disponibilità di scarsa e difficile di cellule primarie richiesto ai ricercatori di sviluppare modelli umani basati su cellule endoteliali immortalizzate cervello o cellule staminali umane^{19,20, 21}. Queste barriere sono surrogati corretto in vitro di BBB a condizione che esprimono gli indicatori delle cellule endoteliali, marcatori di stretta della giunzione, trasportatori di efflusso, vettori soluti, recettori e rispondere a stimoli endoteliale ²⁰. Alcuni modelli BBB utilizzando filtro membrana inserti rivestiti da cellule endoteliali e altri tipi di cellule (cioè, gli astrociti, neuroni o periciti^22,23,24) sono stati analizzati. L’obiettivo di queste co-culture era di aumentare le caratteristiche fisiche di BBB, approfittando della secrezione di fattori solubili da astrociti/neuroni o periciti.

Tuttavia, nessuno di questi modelli include il parenchima cerebrale per studiare e prevedere il destino di un candidato della droga una volta ha superato la barriera. Di conseguenza, il nostro obiettivo era quello di costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di cellule cerebrali miste in un unico kit. Il BBB-Minibrain utilizza un sistema di cultura costituito da un filtro poroso inserito in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule del multiwell. Il filtro è ricoperto con cellule hCMEC/D3, una linea di endothelial delle cellule di cervello umano che è stata dimostrata altamente affidabile per droga BBB test^25,26,27, per formare la BBB. Il Minibrain, che è una cultura co-differenziata dei neuroni umani e astrociti derivati dal NTera/Cl2.D1 cella linea^28,29 misto insieme con la linea cellulare umana microglial CHME/Cl5³⁰ in rapporto corrispondente alla microglia vs rapporti di neuroni-astrociti del cervello³¹, è coltivata anche nella parte inferiore della piastra.

Oltre a studiare il passaggio di farmaci attraverso la barriera emato-encefalica e il loro destino nel parenchima, l’interfaccia di emato-encefalica in cellulo modello potrebbe essere un potente strumento per affrontare l’ingresso di agenti patogeni nel cervello (neuroinvasiveness), la dispersione nel cervello (neurotropism) e la tossicità (neurovirulence) che possano esercitare sulle cellule di parenchima del cervello. Studi neurovirulence e neuroinvasiveness sarebbero beneficiare dello sviluppo di un efficiente modello di cellulo ed essere vantaggioso sostituire modelli animali. Utilizzando il kit di BBB-Minibrain³², abbiamo dimostrato il fenotipo neuroinvasive di rari mutanti virali che accumulato nel ceppo di virus neurotropi francese del Virus della febbre gialla (vale a dire, FNV-YFV^33,34) utilizzato per preparare un interrotto il vaccino vivo YFV e il passaggio di una biomolecola neuroregenerative e neuroprotective, chiamato Neurovita (d’ora in poi denominato NV nel manoscritto)³⁵. Perché NV né naturalmente attraversa la membrana delle cellule, né la BBB, NV è stata fusa con la parte variabile (VHH) di un anticorpo di singola catena di lama che attraversa le membrane biologiche, tra cui la BBB e funziona come una cella penetrante molecola (CPM)³⁶. La proprietà CPM di VHH sembra dipendere il punto isoelettrico e la lunghezza dei VHH³⁷.

Questo test cellulo dovrebbe rendere possibile ordinare le molecole che potenzialmente potrebbero attraversare la BBB prima realizzazione di farmacocinetica e farmacodinamica analisi negli animali e idealmente nello stesso tempo essere in grado di prevedere il loro comportamento nel sistema nervoso parenchima. Questo sistema è biologicamente rilevanti e facile da impostare e gestire da professionisti ben addestrati in cella cultura^26,29,30,38. L’interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: ridurre i costi di test preclinici su una mano e riducendo l’uso di sperimentazione animale d’altra parte.