Aqui nós apresentamos um protocolo descreve a configuração de um cellulo em BBB (barreira hemato-encefálica)-cultura de poliéster membrana porosa Minibrain inserir o sistema a fim de avaliar o transporte de biomoléculas ou agentes infecciosos em um BBB humana e seus fisiológico impacto sobre as células cerebrais vizinhas.
Início da triagem de medicamentos do sistema nervoso em uma pertinente e fiável no modelo BBB cellulo para sua penetração e sua interação com a barreira e o parênquima cerebral é ainda uma necessidade insatisfeita. Para preencher esta lacuna, nós projetamos um 2D no modelo cellulo, o BBB-Minibrain, combinando um poliéster membrana porosa cultura inserir BBB modelo humano com um Minibrain formado por uma tri-cultura de células do cérebro humano (neurônios, astrócitos e células microglial). O BBB-Minibrain nos permitiu testar o transporte de um candidato de medicamento neuroprotetor (por exemplo, Neurovita), através do BBB, para determinar o direcionamento específico desta molécula de neurônios e para mostrar que a propriedade neuroprotetor da droga foi preservada após a droga tinha atravessado o BBB. Também demonstrámos que BBB-Minibrain constitui um modelo interessante para detectar a passagem de partículas de vírus através da barreira de células endoteliais e monitorar a infecção do Minibrain por neuroinvasive partículas de vírus. O BBB-Minibrain é um sistema confiável, fácil de manusear para pesquisador treinado em tecnologia de cultura de células e preditiva de fenótipos de células do cérebro após tratamento ou insulto. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: introdução derisking passos no início do desenvolvimento da droga, por um lado e reduzindo o uso da experimentação por outro animal.
O cérebro é separado da circulação sistêmica por uma estrutura não-permeável que restringe as trocas entre o parênquima cerebral e o sangue, chamado a barreira hemato – encefálica (BBB). Na sua maioria composta de células endoteliais cerebrais, o BBB dinamicamente interage com astrócitos, micróglia perivascular e neurônios do parênquima cerebral vizinhas. As três principais funções do BBB são a criação e a manutenção da homeostase iónica para funções neuronais, fornecimento do cérebro com nutrientes e proteção contra lesões tóxicas ou entrada de patógenos1,2, que contribuem para a manutenção da homeostase do cérebro e suas funções3. Esta barreira é tão eficiente que apenas alguns medicamentos podem atravessar o BBB4,5. Actualmente, os métodos disponíveis para prever se uma molécula irá passar o BBB e se espalham o cérebro consistem em ex vivo estudos sobre rastreamento de imagem material, autópsia do cérebro de voluntários humanos por ressonância magnética (ressonância magnética) ou PET (posição de emissão tomografia computadorizada) ou farmacodinâmica e farmacocinéticos estudos pré-clínicos em animais6,7,8. Estas técnicas e modelos têm algumas limitações, como a resolução limitada do animal de estimação e a baixa sensibilidade de MRI6,8, a dificuldade de quantificar as moléculas (ou seja, moléculas de anticorpo com base, por exemplo) que mal penetrar o cérebro7e para o pré-clínicos estudos seu alto custo e estância de testes em animais.
O último ponto é importante porque, de acordo com a 3R regras, (substituição, redução e refinamento de experimentação animal) as administrações reguladoras pediram que os pesquisadores desenvolvem urgentemente alternativa cientificamente precisa ao animal experimentação9,10,11,12,13,14,15.
Nas últimas décadas, têm sido propostos vários modelos in vitro de BBB16,17,18 cultivando em filtro de membrana insere células endoteliais de diferentes espécies como o rato, rato, bovinos e suínos. Quanto a espécie humana é, a disponibilidade escassa e difícil de células primárias levou os pesquisadores a desenvolver modelos humanos baseados em células endoteliais do cérebro imortalizado ou células-tronco derivadas humanos19,20, 21. Estas barreiras são substitutos in-vitro adequados do BBB desde que eles expressam marcadores de célula endotelial, marcadores de junção apertada, transportadores de efluxo, portadores de soluto, receptores e responder a estímulos endotelial 20. Alguns modelos BBB usando inserções de filtro membrana revestidas com células endoteliais e outros tipos de células (ou seja, astrócitos, neurônios ou pericitos22,23,24) foram analisados. O objetivo dessas culturas co era aumentar as características físicas do BBB, aproveitando a secreção de fatores solúveis por astrócitos/neurônios ou pericitos.
No entanto, nenhum destes modelos inclui o parênquima cerebral para estudar e prever o destino de um candidato de drogas, uma vez que passou a barreira. Portanto, nosso objetivo era construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de células cerebrais mistas em um único kit. O BBB-Minibrain usa um sistema de cultura que consiste em um filtro poroso, inserido em um poço de uma placa de cultura de células do multiwell. O filtro é revestido com células hCMEC/D3, uma linhagem de células endoteliais de cérebro humano que tem sido provada altamente confiável para droga BBB teste25,26,27, para formar o BBB. O Minibrain, que é uma cultura co diferenciada dos neurônios humanos e astrócitos derivados de28,o NTera/Cl2.D1 célula linha29 misturado junto com a linha de celular humana microglial CHME/Cl530 em proporção correspondente a microglia vs rácios de neurônio-astrócitos do cérebro31, é cultivada na parte inferior da placa bem.
Além de estudar a passagem de drogas através do BBB e o destino no parênquima, a interface de sangue-cérebro em cellulo modelo poderia ser uma ferramenta poderosa para lidar com a entrada de agentes patogénicos para o cérebro (neuroinvasiveness), a dispersão para o cérebro (neurotropismo) e a toxicidade (neurovirulence) podem exercer em células do parênquima cerebral. Estudos de Neurovirulence e neuroinvasiveness iria beneficiar o desenvolvimento de um eficiente no modelo cellulo e ser vantajoso para substituir os modelos animais. Usando o kit de BBB-Minibrain32, demonstrámos que o fenótipo neuroinvasive de raros mutantes virais que acumulados na francês neurotrópica estirpe do vírus do vírus da febre amarela (ou seja, FNV-YFV33,34) usada para preparar um descontinuados vacina viva YFV e a passagem de uma biomolécula neuroregenerative e neuroprotetor chamada Neurovita (conhecido como NV doravante no manuscrito)35. Porque NV nem naturalmente atravessa a membrana celular nem o BBB, NV foi fundida com a parte variável (VHH) de um anticorpo de cadeia única de lhama que atravessa as membranas biológicas incluindo o BBB e funciona como uma célula penetrante molécula (CPM)36. A propriedade CPM de VHH parece depender o ponto isoelétrico e o comprimento da VHH37.
Isto em cellulo teste deve tornar possível classificar as moléculas que potencialmente poderiam cruzar o BBB antes da realização de farmacocinética e análise farmacodinâmica em animais e, idealmente, ao mesmo tempo ser capaz de prever seu comportamento no sistema nervoso parênquima. Este sistema é fácil de configurar e manipular por profissionais bem treinados em cultura celular26,29,30,de38e biologicamente relevantes. O interesse de tais testes cellulo seria dupla: reduzindo os custos dos testes pré-clínicos de um lado e reduzir a utilização de testes em animais por outro lado.
Neste artigo demonstramos como construir um cellulo em interface de sangue/cérebro, o BBB-Minibrain, combinando-se um modelo BBB e uma cultura de misturado cérebro células cerebrais (Minibrain) em um único kit. Este sistema é fácil de configurar e manipular para experimentadores bem treinados em cultura de células, biologicamente relevantes.
Quanto a qualquer outro modelo in vitro de BBB, seria obtidos resultados fiáveis se drástico controle da tensão da barreira é aplicado. Inserç…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi suportado por concessões internas do Institut Pasteur incluindo uma subvenção Incitative (PTR 435) e por uma concessão “Contrat de Soutien à la Recherche” fornecido pela Sanofi Pasteur ao Institut Pasteur. A. da Costa foi apoiado pela concessão de Sanofi-Pasteur e Florian Bakoa é beneficiário de uma bolsa de doutoramento fornecida pelo ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Estamos em dívida para Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florença Miller para debates úteis.
12 well plates | Corning | 3336 | |
5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
CMC | Calbiochem | 217274 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |