מדידות אוטומטיות שינה ופעילות גינקולוגיות Cavefish מקסיקני
Summary
פרוטוקול זה מפרט את המתודולוגיה לכימות תנועת התנהגות גינקולוגיות ולישון ב cavefish מקסיקני. ניתוחים קודמים מורחבות כדי למדוד ההתנהגויות בדגים שוכנו מבחינה חברתית. מערכת זו ניתן להחיל באופן נרחב כדי ללמוד שינה ופעילות מינים דגים אחרים.
Abstract
מעבר phyla, שינה מאופיין על ידי מאפיינים התנהגותיים מאוד שנשמרת כוללות סף גירוי גבוה ריבאונד בעקבות מניעת שינה, המאוחדים תקופות של פקקת התנהגותית. Cavefish מקסיקני, Astyanax mexicanus (mexicanus א), הוא מודל לימוד האבולוציה תכונה בתגובה ההפרעות סביבתיים. Mexicanus א קיים כמו צורות השטח-דיור עיניים אוכלוסיות מרובות עיוור המערה-דיור שיש הבדלים מורפולוגיים והתנהגותיים חזקים. אובדן שינה אירעה באוכלוסיות מרובות, cavefish התפתחו באופן עצמאי. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לכימות שינה ופעילות גינקולוגיות מערת mexicanus א ודגים משטח. מערכת ניטור וידאו חסכוני מאפשר הדמיה התנהגותית של המלון שוכן באופן אינדיבידואלי זחל או למבוגרים דגים לתקופות של שבוע או יותר. המערכת ניתן להחיל לדוג בגילאי 4 ימים הפריה פוסט דרך לבגרות. ניתן גם להתאים את הגישה מודדים את ההשפעות של אינטראקציות חברתיות על שינה על ידי רישום מרובים דגים בזירה יחיד. בעקבות הקלטות התנהגותית, ניתוח המידע באמצעות כלים אוטומטיים תוכנת מעקב, ניתוח שינה מעובד באמצעות קבצי script מותאמים אישית זה לכמת משתנים שינה מרובים כולל משך הזמן, מה דעתך על אורך ומספר מה דעתך. מערכת זו ניתן ליישם מידה שינה, התנהגות היממה, ופעילות גינקולוגיות כמעט כל מיני דגים כולל דג זברה, sticklebacks.
Introduction
שינה מאוד כולו בכל רחבי ממלכת החי-2,1,3רמות פיזיולוגיים, פונקציונלי, התנהגותיים. בזמן שינה בחיות מעבדה יונקים מוערך בדרך כלל באמצעות electroencephalograms, הקלטות אלקטרופיזיולוגיות הם פחות מעשית במערכות קטנות דגם גנטית קלה, ובכך שינה בדרך כלל נמדד בהתבסס על התנהגות3 , 4. ובמאפיינים התנהגותיים הקשורים שינה מאוד נשמרים בכל רחבי ממלכת החי, כוללים עוררות מוגברת הסף, הפיכות עם גירוי, תרדמה ממושכת התנהגותית5. אמצעים אלה ניתן לאפיין שינה בבעלי חיים החל התולעת נמטודות, C. elegans, בני6.
השימוש של תרדמה התנהגותית לאפיין שינה דורש תוכנת מעקב אוטומטי. עם תוכנת מעקב, תקופות של פעילות של פקקת נקבעים על פני מספר ימים, תקופות ארוכות של חוסר פעילות מסווגים כמו לישון7,8. בשנים האחרונות פותחו מספר מערכות מעקב לרכישת פעילות נתונים בין מגוון של מערכות קטן דגם גנטית קלה; כולל תולעים, זבובי פירות, דגים9,10,11. תוכניות אלה מלווים על ידי תוכנה המאפשרת למעקב אוטומטי של התנהגות בעלי חיים, כולל קוד פתוח freeware והן תוכנה זמינים מסחרית7,12,13,14 . מערכות אלו נבדלים הגמישות שלהם ויאפשרו הקרנה יעילים ואפיון של שינה פנוטיפים במודלים גנטית amendable רבים.
החקירה גנטי שינה דג זברה, רזבורה rerio, הוביל הזיהוי של מספר גנים של המעגלים העצביים המסדירים שינה15,16. בזמן זה סיפק מערכת חזקה על חקירת הבסיס העצבי של שינה בכל חיית מעבדה חוליות, היא הרבה פחות ידוע על איך מתפתח שינה וטבעי איך וריאציה תורם לישון רגולציה. Cavefish מקסיקני, Astyanax mexicanus (A. mexicanus), התפתחו הבדלים דרמטיים שינה, פעילות גינקולוגיות, השעון הביולוגי17,18. דגים אלה קיימים כמו דגים משטח עיניים המאכלסים הנהרות של מקסיקו, דרום טקסס, לפחות 29 מערת אוכלוסיות האזור בסיירה דל אברה של מקסיקו הצפון19,20,21. למרבה הפלא, הבדלים התנהגותיים רבים, כולל אובדן שינה, להופיע הופיעו באופן עצמאי מספר cavefish אוכלוסיות14,22. לכן, cavefish מספקות מודל של חוקר את התפתחות מתכנסת שינה, היממה, והתנהגויות חברתיות.
פרוטוקול זה מתאר מערכת למדידת שינה והתנהגות גינקולוגיות א’. הזחלים mexicanus ומבוגרים. מערכת הקלטה מבוססי אינפרא אדום לפי הזמנה מאפשר הקלטת וידאו של בעלי חיים בתנאים כהים ובהירים. ניתן להשתמש בתוכנה זמינים מסחרית כדי למדוד פעילות, להשתמש בפקודות מאקרו מותאם אישית כדי לכמת את מספר היבטים של חוסר פעילות, לקבוע תקופות של שינה. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר שינויים ניסיוני לצורך מעקב אחר הפעילות של חיות מרובות בתוך טנק, מתן היכולת לבדוק אינטראקציות בין שינה והתנהגויות חברתיות. מערכות אלה ניתן ליישם מידה שינה, התנהגות היממה, ופעילות גינקולוגיות זני דגים נוספים כולל דג זברה, sticklebacks.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מערכת מותאמת אישית עבור לכימות שינה ופעילות גינקולוגיות cavefish הזחל ומבוגרים. Cavefish הופיעו כמודל מוביל לימוד האבולוציה של שינה יכול לשמש כדי לחקור את הבסיס הגנטי והעצבים של שינה בתקנה1. השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה כוללים אופטימיזציה של תאורה, איכות וידאו כדי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי פרס NIGMS GM127872 ACK, פרס NINDS 105072 ERD ולאחר אישור NSF פרס 1656574 אק.
Materials
| 12V power adaptor | Environmental Lights | 24 Watt 12 VDC Power Supply | |
| Acrylic dividers (adults) | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Adult infrared light power source | Environmnental Lights 24 Watt 12 VDC Power Supply | ||
| Battery pack | CyberPower | CP850PFCLCD | |
| Camera lens (adult) | Navitar Zoom 7000 | Zoom 7000 | |
| Camera lens (larval) | Fujian 35mm f/1.7 | B01CHX7668 | Purchase on Amazon |
| Camera lens adapter | d | 1524219 | |
| Camera mount | CowboyStudio Super Clamp | B002LV7X1K | Purchase on Amazon |
| Fish tank | Deep Blue Professional | ADB11006 | |
| Heat sink (adult) | M-D Building products | SKU: 61085 | Cut to fit |
| Heat sink (larval) | M-D Building products | SKU: 57000 | Cut to fit |
| Infrared lights (adults) | Environmental Lights Infrared 850 nm 5050 LED strip | irrf850-5050-60-reel | Cut to fit |
| Infrared lights (larval) | LED World | B00MO9H7H4 | Purchase on Amazon |
| IR-diffusing acrylic | TAP Plastic | Order sheets in sizes as needed | |
| Laptop/computer | N/A | N/A | Any laptop will work. |
| LED light | Chanzon 10 High Power Led Chip 3W White (6000K-6500K/600mA-700mA/DC 3V-3.4V/3 Watt) | B06XKTRSP7 | Use with Chanzon 25pcs 1W 3W 5W LED Heat Sink (2 pin Black) Aluminum Base Plate Panel |
| light timer | Century 24 Hour Plug-in Mechanical Timer Grounded | ||
| Plastic wall mount for IR | Everbilt Plastic pegboard | Model # 17961 | |
| Power cable | BNTECHGO 22 Gauge Silicone Wire | B01K4RPE0Y | |
| Power source | Rapid LED | MOONLIGHT DRIVER (350MA) | |
| Tissue culture plates | Fisherbrand | 12-well (FB012928) 24-well (FB012929) | |
| Tripod Ball head | Demon DB-44 | B00TQ54CZO | Purchase on Amazon |
| USB Hardrive | Seagate 3TB backup | STDT3000100 | |
| USB Webcam | Microsoft LifeCam | Q2F-00014 | Purchase on Amazon |
| Wall mount for camera | LDR Industries 1/2" Steel pipe | 307 12X36 | Mounted on wall with Flange and 90 degree pipe elbow. Could also use a tripod to hold camera. |
Referências
- Keene, A. C., Duboue, E. R. The origins and evolution of sleep. The Journal of Experimental Biology. , (2018).
- Joiner, W. J. Unraveling the Evolutionary Determinants of Sleep. Current Biology. 26 (20), R1073-R1087 (2016).
- Allada, R., Siegel, J. M. Unearthing the phylogenetic roots of sleep. Current biology. 18, R670-R679 (2008).
- Sehgal, A., Mignot, E. Genetics of sleep and sleep disorders. Cell. 146, 194-207 (2011).
- Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep: a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8, 269-300 (1984).
- Raizen, D. M., et al. Lethargus is a Caenorhabditis elegans sleep-like state. Nature. 451, 569-572 (2008).
- Geissmann, Q., Rodriguez, L. G., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. Ethoscopes: An Open Platform For High-Throughput Ethomics. bioRxiv. , 113647 (2017).
- Garbe, D. S., et al. Context-specific comparison of sleep acquisition systems in Drosophila. Biology Open. 4 (11), (2015).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Gilestro, G. F., Cirelli, C. PySolo: A complete suite for sleep analysis in Drosophila. Bioinformatics. 25, 1466-1467 (2009).
- Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nature Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6, 451-457 (2009).
- Rihel, J., et al. Zebrafish behavioral profiling links drugs to biological targets and rest/wake regulation. Science (New York, N.Y.). 327, 348-351 (2010).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13, (2015).
- Chiu, C. N., Prober, D. A. Regulation of zebrafish sleep and arousal states: current and prospective approaches. Frontiers in Neural Circuits. 7 (April), 58 (2013).
- Elbaz, I., Foulkes, N. S., Gothilf, Y., Appelbaum, L. Circadian clocks, rhythmic synaptic plasticity and the sleep-wake cycle in zebrafish. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21, 671-676 (2011).
- Beale, A., et al. Circadian rhythms in Mexican blind cavefish Astyanax mexicanus in the lab and in the field. Nature Communications. 4, 2769 (2013).
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Jeffery, W. R. Regressive evolution in Astyanax cavefish. Annual Review of Genetics. 43, 25-47 (2009).
- Gross, J. B. The complex origin of Astyanax cavefish. BMC Evolutionary Biology. 12, 105 (2012).
- Aspiras, A., Rohner, N., Marineau, B., Borowsky, R., Tabin, J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9688 (2015).
- Jaggard, J., et al. The lateral line confers evolutionarily derived sleep loss in the Mexican cavefish. Journal of Experimental Biology. 220 (2), (2017).
- Jaggard, J. B., Stahl, B. A., Lloyd, E., Prober, D. A., Duboue, E. R., Keene, A. C. Hypocretin underlies the evolution of sleep loss in the Mexican cavefish. eLife. , e32637 (2018).
- Hinaux, H., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pacho ´n Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., La Schimmenti, ., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
- Bilandzija, H., Ma, L., Parkhurst, A., Jeffery, W. A potential benefit of albinism in Astyanax cavefish: downregulation of the oca2 gene increases tyrosine and catecholamine levels as an alternative to melanin synthesis. Plos One. 8 (11), e80823 (2013).
- Yokogawa, T., et al. Characterization of sleep in zebrafish and insomnia in hypocretin receptor mutants. PLoS Biology. 5, 2379-2397 (2007).
- Appelbaum, L., et al. Sleep-wake regulation and hypocretin-melatonin interaction in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 21942-21947 (2009).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. eLife. 4 (September), (2015).
- Elipot, Y., Hinaux, H., Callebert, J., Rétaux, S. Evolutionary shift from fighting to foraging in blind cavefish through changes in the serotonin network. Current Biology. 23 (1), 1-10 (2013).
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The evolutionary biology of the threespine stickleback. 584, (1994).
- Seehausen, O. African cichlid fish: a model system in adaptive radiation research. Proceedings of Biological Sciences/The Royal Society. 273 (1597), 1987-1998 (1597).
- Basolo, A. L. Female preference predates the evolution of the sword in swordtail fish. Science. 250, 808-810 (1990).
