급진적 인 전립선 절제술에 따른 발기 부전의 치료를위한 지방 유래 재생 세포의 분리

프로토콜에 설명 된 모든 방법은 덴마크 국가 윤리위원회 (No. 37054), 덴마크 보건 의약품 당국 (EUDRA-CT 번호 2013-004220-11) 및 덴마크 데이터 보호국 (2008-58-0035)의 승인을 받았습니다. 이 연구는 ClinicalTrials.gov (NCT02240823)에 등록되었습니다. 이 연구는 Odense University Hospital의 GCP (Good Clinical Practice) 부서에서 모니터링 한 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. ADRC 제제는 오덴세 대학 병원 (덴마크 건강 및 의약품 당국, 허가 번호 29035)에서 인간 조직 및 세포의 취급을위한 공인 조직 설립에서 수행되었다. 1. 환자/참가자 모집 임상시험에 참여하려면 다음과 같은 포함 기준을 충족하는 환자를 모집합니다. 18세 이상이고, RP 전에 성적으로 활동적이며, 인간 면역 결핍 바이러스 감염, 매독 또는 간염과 같은 성병에 감염되지 않은 환자를 모집합니다. 전립선 암으로 인해 수행 된 RP 후 발기 부전으로 고통 받고 있는지 확인하십시오.참고 :이 연구에서 환자는 RP 후 5-18 개월 후에 연구에 등록되었으며 수술 방법에 관계없이 포함되었습니다 : 개방 / 로봇 보조 또는 신경 절약 / 비 신경 절약. 전립선 특이 항원 (PSA)의 값이 RP 후 임상 후속 조치에서 검출 할 수 없도록하십시오. 환자가 RP 전에 성적으로 활동적이었는지 확인하고, RP 후에도 성적으로 활동적이기를 바란다는 소망을 표현하십시오. 포스포디에스테라제 타입 5 억제제 (PDE5 억제제) 또는 프로스타글란딘 E1 (PGE1)의 합성 유사체에 대한 약리학적 개입이 참여하기 전에 시도되었고 불충분하다고 간주되었는지 확인하십시오. 또한 환자가 복부 또는 허벅지에 충분한 피하 지방이 있는지 확인하십시오. RP 중 마취하에 심각한 사건이 발생했거나 항응고제로 치료 한 경우 임상시험에서 환자를 제외하십시오. 2. 지방 흡입 참고: 지방 흡입은 피하 부위에서 지방이나 지방세포를 제거하는 수술입니다. 프로토콜의이 부분은 표준 지방 흡입술로 수행되며 절차는 수술실에서 멸균 조건에서 수행됩니다. 시술에 사용되는 모든 기구는 멸균되어야 하며 외과의는 스크럽, 멸균 수술 가운, 멸균 장갑, 수술용 마스크 및 모자를 착용해야 합니다. 환자를 마취하십시오. 환자가 절차 중에 전신 마취 중인지 확인하고이 부분은 마취 전문의가 수행합니다. 클로르헥시딘 0.5 % (클로르헥시딘 정신, 96 % 에탄올 약용 클로르헥시딘 디글루코 네이트 77 % W / W = 83 % v / v)로 복부와 음낭의 피부를 소독하십시오. 복부 상의 부위를 그리기 위해 수술 마커를 사용하여 지방 흡입이 수행될 것이다. 이 영역은 일반적으로 대칭과 umbilicus 사이의 영역입니다. 메스로 복부 피부에 두 개의 6mm 너비의 절개를 만듭니다 (숫자 11). 지방 흡입의 위로 그려진 영역에서 대칭 및 측면으로 절개를 놓습니다. 절개에 이러한 석유 젤리와 같은 윤활제를 약간 넣어 지방 흡입 중에 침윤 캐뉼라가 절개 안팎으로 쉽게 미끄러 지도록하십시오. 피부의 절개를 통해 크기 14G 침윤 캐뉼라를 도입하십시오. 변형된 Kleins 용액을 피부 표면과 평행한 표시된 부위에 피하 주사하십시오. 용액을 너무 많이 주입하여 표적 조직이 부어 오르고 단단해지거나 종양이 생깁니다.참고: 변형된 Kleins 용액은 1,000mL 링거 락테이트와 1mg의 아드레날린(에피네프린(1:1,000,000))의 용액으로 구성됩니다. ADRC에 부정적인 영향을 줄 수 있으므로 국소 마취를 용액으로 엉덩이로 만들지 마십시오. 지방 조직에 대한 비율 1:1에 해당하는 변형된 Kleins 용액의 부피를 주입한다. 아드레날린의 효과를 극대화하고 수확 된 지방 조직에서 혈액의 양을 줄이기 위해 10 분 동안 기다리십시오. 제트 주입 지방 흡입을 사용하여 표준 지방 흡입을 수행하여 200-300 mL의 지방 조직을 수확하십시오. 주입 튜브와 노즐이 통합 된 빈 무딘 캐뉼라를 사용하십시오. 캐뉼라를 지방 흡입을위한 흡입 장치에 부착하십시오.참고 : 연속 팬 모양의 물 주입은 지방 조직을 캐뉼라의 개구부를 통해 쉽게 흡입 될 수있는 파편으로 느슨하게합니다. 복부의 절개를 통해 무딘 팁이있는 3mm 주사기를 소개하십시오. 지방 조직을 리포 콜렉터에 수집하여 멸균 환경에서 리포흡염수를 보존한다. 지방 흡인물은 물 단계에서 분리되기 시작할 것입니다. 50 mL 멸균 주사기를 사용하여 리포 수집기에서 지방 흡인물을 빨아 들입니다. 주사기에서 빨려 들어가는 물의 양을 최소화하고 주사기 끝의 플러그를 조여서 지방 조직을 멸균 상태로 유지하십시오. 팁이 있는 주사기를 멸균 비닐 봉지에 아래쪽으로 두어 물 단계에서 지방 흡인물을 분리하기 시작합니다. 분리를 계속하기 위해 팁이 아래쪽을 향하도록 멸균 용기에 가방을 넣으십시오. 운송 중 멸균 환경을 확보하기 위해 멸균 드레이프로 컨테이너를 덮으십시오.참고 : 격리에 사용 된 기계의 사용 설명서에 따르면 지방 흡인물은 ADRC를 분리하기 전에 최대 4 시간 동안 저장할 수 있지만 항상 즉시 처리합니다. 외과 의사가 선호하는 봉합사 재료로 피부 절개를 닫습니다. 수술 후 부종을 줄이기 위해 복부 주위에 압축 의류, 복부 바인더를 놓습니다. 5 μg의 아드레날린이 들어있는 20 mL 부피바카인 5 mg / mL를 주입하여 음경 블록을 만드십시오. 20 mL 주사기를 사용하고 1 1/4 인치 길이의 23G 바늘로 바릅니다. 5 mL의 부피바카인을 서브 큐티스의 각 사분면에 바르십시오. bupivacaine을 두 부위에 주사하고, 하나는 심실로 다른 부위를 dorsally로 놓습니다. 바늘을 옆으로 오른쪽으로 향하게하는 피하 조직에 바늘 전체 길이를 도입하고 바늘이 수축 될 때 마취를 주입하십시오. 바늘을 왼쪽으로 향하게하는 주사를 반복하십시오.참고 : 환자는 이제 마취 전문의에 의해 전신 마취에서 깨어날 수 있습니다. 3. ADRC의 격리 참고: ADRC의 분리 프로세스는 장치 다음 사용 설명서에 자세히 설명된 대로 수행됩니다( 자료 표 참조). ADRC를 정제하는 동안 지방 흡인물이 오염 물질에 노출되지 않도록 멸균 조건 하에서 절차를 수행하는 것이 중요합니다. ADRCs의 분리에 걸리는 시간은 지방 흡인물의 부피에 따라 다르지만, 전체 절차는 여기에 설명 된대로 반자동 장치를 사용하여 약 2.5 시간이 소요됩니다. 모든 소모품과 효소를 멸균 일회용 수술 타월로 덮인 테이블 위에 무균 적으로 놓습니다.참고: 절차 키트에는 한 환자로부터 ADRC를 분리하는 데 필요한 모든 필수 소모품과 효소가 들어 있습니다. 이 외에도 37-39 °C, 젖산 링거의 한 리터 주입 가방 세 개는 소독을 위해 멸균 된 의복, 장갑 및 수건 및 에탄올과 함께 사용할 수 있어야합니다. 모든 소모품과 효소의 많은 숫자와 시스템에 연결되었을 때 젖 분비 링거의 온도를 기록하십시오. 에탄올로 장치를 닦아내고 제조업체의 지침에 따라 닦으십시오. 소모품 세트를 장치에 로드하고 젖 분비 링거 봉지를 시스템에 연결합니다. 지방 흡인물을 추가하기 전에 일련의 반자동 테스트 (시스템 검사 및 누출 테스트)를 수행하십시오. 3.1의 단계가 수행되는 동안 지방 흡인물을 50 mL 튜브에 방치하십시오. 이렇게하면 지방이 액상으로부터 분리 될 수 있습니다. 지방 조직의 총량(mL 단위)을 기록하고 로드된 지방의 양이 장치 용량의 범위에 속하는지 확인하기 위해 이것을 사용하십시오. 장치에서 메시지를 표시할 때 조직을 로드합니다. 기계는 이제 과도한 액체를 배출하고 수유 링거로 씻기 전에로드 된 지방 조직의 양을 측정합니다. 조직이 세척되고 다시 배수되면 기계가 요청할 때 새 주입 백을 37-39 °C 젖 분비 링거와 연결하십시오. 5 mL Lactated Ringers에서 콜라게나제 및 프로테아제 블렌드를 함유하는 시판되는 효소를 재구성한다 (효소의 한 바이알은 최대 270 mL의 지방량에 충분하다). 장치가 지방 조직과 함께 용기에 주입하는 효소의 양 (조직 중량 기준)을 표시하는지 확인하십시오. 일단 주입되면, 교반하에 수행되는 효소 소화는 약 20 분 동안 지속됩니다. 조직 소화 후, 교반기를 멈추고 함량이 두 단계로 분리되었는지 확인하십시오 : 상부 지질 함유, 황색 상 및 ADRC가 포함 된 하부 분홍색 층. 후자의 층이 소모품 세트의 세포 처리 챔버 (즉, 장치 내장 원심분리기로 들어가는)로 배수되도록하고, 지질 층을 뒤에 남겨 두십시오. ADRCs를 원심분리의 다중 라운드 동안 세포 처리 챔버에서 농축시킨다. 이제 수유 링거에 재구성 된 10mL의 인트라 바스 (최종 ADRC 현탁액에서 덩어리를 피하는 데 도움이되는 DNase 포함)를 추가하십시오. 효소 반응은 ADRC를 세척 한 후 10 분 동안 지속됩니다.참고: 이 단계는 완전히 자동이며 프로세스가 완료되면 기계가 알려줍니다. ADRCs의 단리가 완료되면, 세포를 5 mL의 링거 락테이트에 재현탁시킨다. 용액을 5 mL 주사기에 넣고 흡인한다. ADRCs를 함유하는 5 mL 주사기 상에 3-웨이 스토콕 여성 루어락을 장착하고, ADRCs 4 mL를 또 다른 5 mL 멸균 주사기 내로 흡인시킨다. 마지막 1 mL를 1 mL 주사기로 옮깁니다. ADRC 특성화, 예를 들어, 세포 수, 세포 생존력, 유세포 분석기 및 ADRC 분화 능력에 의한 표면 마커의 분석을 위해 이 1 mL를 사용한다. 멸균 드레이프에 포장되기 전에 4 mL의 ADRC가 들어있는 5 mL 주사기 위에 25 G 바늘을 올려 놓으십시오. ADRC를 사용하여 수신자에게 주입하십시오. 이 경우 ADRC의 용액은 평균 8.4-32.7 백만 개의 세포를 포함합니다. 4. ADRC를 코포라 캐버노섬에 이식 참고: 이것은 멸균 절차입니다. 모든 장비는 멸균되어야하며, 줄기 세포가 들어있는 용액을 코포라 캐버노섬에 주입하는 사람은 멸균 장갑을 착용해야합니다. 환자는이 절차 중에 깨어 있으며 자신의 줄기 세포를 받게됩니다. ADRCs는 주사 전에 세포를 세지 않고 주입된다. ADRCs의 용액이 코포라 캐버노섬에 주입될 때까지 주사기를 부드럽게 기울여 균질하게 유지하십시오. 조리개 드레이프를 음경 위에 놓습니다. 실리콘 용기 루프를 사용하여 음경의 뿌리에 지혈대를 놓습니다. 루프를 조이고 구부러진 완두콩 포셉으로 고정하십시오. 지혈대를 음경에서 혈류를 막을 수있을만큼 단단히 만드십시오. 두 개의 방부제 스왑을 사용하여 주사 부위 (코포라 캐버노섬의 측면 부위)에서 음경 피부를 소독하십시오. ADRCs를 함유 한 용액 1 mL를 두 개의 다른 장소에서 오른쪽의 코포라 cavernosum에 직접 각도로 주입하고 나중에 왼쪽 코포라 캐버노섬에서이 단계를 반복하십시오. 주입된 ADRCs의 총 부피는 4 mL이다. 30 분 동안 기다린 다음 지혈대를 제거하십시오. ADRCs의 주사 후 관찰 2시간 후에 환자를 배출하여, 마취 후 환자가 잘 회복되도록 한다. 5. 수술 후 관리 혈종의 발달을 막기 위해 첫 주 이내에 혈압을 올릴 수있는 신체 수행을하지 말 것을 환자에게 권고합니다. 환자에게 수술 후 처음 14 일 동안 24 시간 동안 복부 바인더를 착용하고 낮에는 14 일 동안 착용하는 것이 좋습니다. 경구 아세트 아미노펜 (예 : 파라세타몰; 1,000mg, 하루 4 회) 및 경구 항염증제 (예 : 이부프로펜; 400mg을 하루 3 회)로 수술 후 통증을 치료하십시오.