결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

참고: 각 고분자 강수량 단계는 수행 순차적으로, 뒤에 세척 일을 동시에; 그러나, RNA 격리를 완료 하려면 것이 좋습니다 처음으로 그것은 본질적으로 안정. 1. 샘플 컬렉션 적절 한 성장 조건1910 cm 접시 당 1, 000 웜 계란 씨앗 72 h 20 ° C에서 품 어.참고: 앞에서 설명한19로 달걀을 수집 하기 위해 계란 베어링 성인 표 백제. M9 버퍼의 약 5 mL와 함께 접시를 세척 하 고 튜브로 1000 성인 벌레를 수집.참고: M9 버퍼는 35 m m 인산 염기 나트륨, 염화 나트륨 102 m m, 22 mM 칼륨 인산 이수소, 및 살 균 물19에서 1 m m 마그네슘 황산의 구성 됩니다. 1000 x g 1 분 동안에 벌레를 원심, 상쾌한, 삭제 하 고 1.5 mL microcentrifuge 튜브 M9 버퍼의 1 mL와 수송과 웜 전송. 다시 1 분 동안 845 x g 에서 원심 및 삭제는 상쾌한의 대부분. 최소 4 h-80 ° C에서 수송과 벌레를 저장 합니다.참고: 냉동된 펠 릿을 사용 하 여 신선한 펠 릿 보다 높은 수익률을 생성 합니다. 일련의 동결/동결 해제 사이클 드라이 아이스에 액체 질소 또는 95% 에탄올을 사용 하 여 웜 표 피를 부를 것이 좋습니다 신선한 펠 릿을 사용 하는 경우. 펠 릿에 작은 양의 M9 떠나 얼 때 표 피를 휴식 하는 데 도움이 됩니다. 2. 뉴클레오티드와 단백질 격리 해 동된 펠 릿에서 어떤 상쾌한을 제거 하 고 차가운 GTCp 시 약의 1 mL을 추가. 아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 10 분 동안 얼음에 샘플을 놓고 가끔 거꾸로 그것을 선회 하 여 그것을 혼합 합니다.주의: 페 놀 부식성, 신경, 그리고 높은 독성 그리고 화학 화상 실명을 일으킬 수 있습니다.참고: 우리 보고 볼륨; 시작 물자로 최대 5000 성인 벌레를 이용 각 볼륨의 GTCp 시 약 1 mL의 사용을 기반으로 합니다. 더 큰 샘플을 사용할 때는 최대 규모 필요할 수 있습니다. 웜 및 GTCp의 솔루션, 감기 클로 프롬의 200 µ L를 추가 합니다. 손가락 사이 튜브를 보유 하 고 적극적으로 악수 15 미 허가 그것 상 온 (RT) 3 분.주의: 클로 프롬 자극성 독성, 피부 염증 및 다른 기관 대상 해가 발생할 수 있습니다 이며 가능한 발암 물질. 13500 x g 4 ° c.에 15 분 동안에 관을 원심참고: 이 회전 후 형성 되는 3 개의 층: 상단, 명확한 수성 단계, 하단, 핑크 유기 단계, 그리고 지질과 DNA를 포함 하는 작은, 흐린 interphase. micropipette를 사용 하 여 새로운 RNase 무료 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (튜브 A) 알코올 (에 설명된대로 2.5 단계) 강 수를 통해 RNA를 분리 하 고 새 튜브 (핑크 레이어 (유기 단계) 나머지 펠 릿에서 이동 하 이동 분명 상위 레이어 (수성 단계) 튜브 B) 얼음에 놓습니다.참고: 분홍색 유기 단계 DNA와 단백질이이 예제에서의 분리까지-80 ° C에서 냉동 수 있습니다. 큰 샘플 수성 및 유기 단계 사이의 두꺼운 흰색 레이어를 생성 합니다. 이 분수는 DNA를 포함합니다. 이 레이어는 다른 단계를 방해 하지 않고 제거할 수 있습니다, 만약 그렇게 하 고 별도 관 (관 B2)에 넣어. 다음과 같이 RNA 격리. 튜브 A에에서 명확한 수성 단계에서 100% 소 프로 파 놀의 500 µ L로 RNA 침전. 실시간에서 10 분 동안 품 어 다음, 4 ° c.에서 10 분 동안 13500 x g 에서 원심 분리기 튜브 A참고: RNA의 작은 흰색 펠 릿은 튜브의 맨 아래에 표시 되어야 합니다. 대부분을 상쾌한의 가만히 따르다. 나머지 1 mL 주사기 바늘으로 제거 하 고 삭제는 상쾌한.참고: 바늘의 크기는 중요 하다; 그러나, 더 큰 바늘 게이지는 펠 렛을 방해으로 하지 그래서 더 많은 제어를 제공 합니다. micropipette 바늘 사용할 수 없는 경우 사용할 수 있습니다. 튜브는 펠 릿을 세척 하는 A 75% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 5300 x g 에서 튜브를 회전 2.5.2, 단계에서 설명한 대로 decanting 바늘, 1 mL 주사기를 사용 하 여는 상쾌한 펠 릿에서 제거 하 고 그것을 폐기. 펠 릿을 하자 5-10 분, 건조 하지만 overdry 그것을 두지 마세요. RNase 무료 물 50 µ L를 사용 하 여 완전히 투명 하 게 되기 전에 RNA의 펠 릿을 다시 구성할.참고: 이것은 1000-3000 벌레에 대 한 적절 한 시작 볼륨 하지만 얼마나 시작 소재 사용에 따라 조정 해야 할 수도 있습니다. 그것을 해산 하기 위해 10 분 동안 55-60 ° C에 펠 릿을 품 어. 농도 및 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 측정 합니다. 기록에서 260 absorbances nm RNA 농도 어떤 불순물을 식별 하기 위해 230, 280 nm에. 모든 오염 물질을 제거, 페 놀 잔류물 또는 DNA, 같은 열 정화 또는 후속 에탄올 세척 및 DNase 치료에 RNA를 청소.참고: 이 시점에서, RNA RNAseq 분석을 위해 보낼 준비가 또는 cDNA 실시간 정량 (자세한 내용은 섹션 3.1 참조)에 사용할 수 있도록 사용할 수 있습니다. RNA-80 ° C에 추가 사용까지 저장할 수 있습니다. 다음과 같이 DNA를 격리 합니다. 튜브 B 핑크 유기 단계 및 튜브 B2, 샘플에서 있는 경우는 반전에 의해 100% 에탄올과 혼합의 300 µ L을 추가 하 여 DNA를 침전. 2-3 분 RT에는 tube(s)를 둡니다. DNA를 펠 렛을 4 ° C에서 5 분 동안 375 x g 에서 B 및 b 2 튜브 원심 새로운 2 mL 튜브 (C 관)에 붓는 의해는 상쾌한 B와 b 2 관에서 이동 하 고 후속 단백질 격리에 대 한 얼음에 두고. 375 x g 4 ° c.에 5 분에서 30 분 원심 분리기 튜브 B 및 b 2에 대 한 10% 에탄올에 0.1 M 나트륨 구 연산 염의 1 mL 튜브 B 또는 b 2에서에서 DNA 펠 릿을 세척참고: 나트륨은 나트륨 시트르산에 에탄올, 불순물 저속 원심 분리에 의해 제거할 수 있도록 DNA 촉진 더 쉽게 만드는 DNA 등뼈에 바인딩합니다. 2.6.3 단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복 합니다. 75% 에탄올 1.5 mL에 펠 릿을 resuspend 고 구도의 여 가끔 혼합과 20 분, RT에 둡니다. 원심 분리기 튜브 4 ° c.에서 5 분 동안 375 x g 에서 B 및 b 2 삭제는 상쾌한 고 5-10 분 동안 건조를 허용 합니다. 8 m m 수산화 나트륨의 150 µ L에 펠 릿을 디졸브. 필요한 경우 HEPES와 원하는 pH를 조정 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 375 x g 에서 샘플을 회전 새로운 튜브는 micropipette를 사용 하 여 상쾌한 (DNA) 이동 합니다. 농도 측정 하 고 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여 결정 합니다. 기록에서 260 absorbances nm와 어떤 불순물을 식별 하기 위해 230 및 280 nm에서 DNA 농도 대 한. 다음과 같이 단백질을 분리. 단백질 침전, 하 관 C, 여러 번을 반전 하 여 혼합에에서 분홍색 상쾌한에 100% 소 프로 파 놀의 최대 1.5 mL를 추가 하 고 10 분 RT에서 품 어. 원심 관 C에서 4 ° c.에서 10 분 동안 13500 x g 삭제는 상쾌한 고 실시간 원심 분리기 튜브 C 5300 x g 4 ° c.에 5 분에서 20 분에 대 한 95% 에탄올에 0.3 M guanidine 염 산 2 mL와 펠 릿을 세척 2.7.3 단계에서 설명한 대로 세척 단계를 반복 2 배. 새로운 1.5 mL 튜브 (튜브 C2)을 단백질 펠 릿을 이동한 95% 에탄올의 최대 1.5 mL를 추가 합니다. 소용돌이 하자 그것은 20 분 동안 RT에 앉아. 원심 관 C2 5300 x g 4 ° c.에 5 분에서 삭제는 상쾌한 고 60 분 동안 50 ° C에서 5 %SDS 300 µ L에서 펠 릿 실시간 디졸브에서 10 분 동안 건조 하는 펠 릿.참고: 장시간 외피 단백질 펠 릿을 완전히 해산 필요할 수 있습니다. 과거에는, 펠 릿은 되었습니다 incubated 최대 6 h에 대 한 품질을 희생 하지 않고도. 원심 관 C2 13500 x g 17 ° c.에서 10 분에서 새로운 튜브에는 상쾌한을 이동 합니다. 세제와 호환 되는 기본 단백질 정량화 분석 결과 사용 하 여 농도 측정 합니다.참고: 단백질은 SDS-PAGE 그리고 서쪽에 게 더 럽 히기에서 사용 될 준비가 되어 있습니다. 그것은 나중에 사용-20 ° C에 저장할 수 있습니다. LC-MS/MS, 같은 다른 기술에 대 한 세제를 dialyzed 해야 합니다. 3. 평가 mRNA와 단백질 수준 실시간 정량 1 반전 녹음 방송으로 cDNA를 준비 다음 thermocycler 프로토콜을 사용 하 여 RNA의 ng: 리버스 전사 (46 ° C에서 20 분), 및 RT 비활성화 (95 ° C에서 1 분) (25 ° C에서 5 분), 못쓰게. CDNA의 주식 접시 96 잘 접시의 개별 우물을 각 cDNA 샘플의 1: 100 희석의 100 µ L을 추가 하 여 확인 합니다. 템플릿/물 전용 웰 스, 그리고 1:400 (분석 하는 샘플의 모든 풀링된 cDNA와 유래)에 1시 25분에서 직렬로 희석된 샘플 등의 적절 한 컨트롤을 포함 설정할 각 유전자 분석에 대 한 입문서 효율 표준 곡선에 대 한 허용.참고: 이 형식은 실시간 정량 접시에 접시에서 모든 샘플의 전송 및 잘-투-잘 pipetting 변형 완화를 위한 96-잘 microdispenser와 함께 사용할 수 있습니다. 적절 한 마스터 믹스 (예를 들어, SYBR + 뇌관) 다중 채널 피 펫과 각각 잘 그 후 추가할 수 있습니다. 전반적으로,이 접근 손을 pipetting 각 샘플, 따라서 더 가변성을 감소 하는 경우 오류를 줄일 수 있습니다. 실시간 정량 Pcr 격판덮개의 우물을 주식 판에서 cDNA의 3 µ L를 추가 합니다. 앞으로 및 역방향 뇌관, 샘플 당 최대 7 µ L를 물 DNA intercalating cyanine 염료, 5 µ M 각의 포함 하는 1 x supermix를 포함 하는 뇌관의 각 집합에 대 한 마스터 믹스를 확인 합니다. 실시간 정량 Pcr 플레이트의 적절 한 우물을 7 µ L을 추가 하 고 가볍게 섞어 선동.참고: 측정 결과20정상화에 대 한 참조로 사용 하는 하우스키핑 유전자 샘플을 포함 합니다. 프라이 머 사용 되 고 있는 실시간 정량 Pcr 프로토콜을 사용 하 여 접시를 실행 합니다. 서쪽 오 점참고: 서쪽 오 점에 대 한 자세한 내용은, 마흐무드와 양21를 참조 하십시오. 2 x Laemmli 샘플 버퍼와 10 분 동안 95 ° C에 종 기의 동일한 양으로 20 µ g 단백질의 결합 하 여 SDS 페이지에 대 한 샘플을 준비 합니다. 4%-15% 트리 스-글리신 젤에 샘플을 로드 하 고 150 V 1 h, 또는 염료 전면 젤의 맨 아래에 도달할 때까지 그들을 실행 합니다. 젤에서 25 V semidry 전송 장치에서 30 분에 니트로 막 단백질을 전송. 막 Ponceau S 얼룩과 얼룩 여 적절 한 전송을 확인 합니다. 철저 하 게 씻어 Tris 버퍼 염 분 (TBS) 0.01% 폴 20 (TBS-T)와 함께 막에서 얼룩. 실시간에서 1 시간에 대 한 TBS T에 5% 탈지 우유와 함께 막 차단 공급 업체의 권장 사항에 따라 적합 한 희석에서 1 차적인 항 체에 멤브레인을 품 어. 두고 4 ° C에서 로커에 하룻밤. 씻고 막 3 x 5 분 각, TBS.와 공급 업체의 권장 사항에 따라 적절 한 희석에 적절 한 이차 항 체에 멤브레인을 품 어. 실시간에서 1 h 로커에 두고 씻고 막 3 x 5 분 각, TBS.와 이미지 하 고 계량 기본 방법을 사용 하 여 서쪽 오 점.