מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking
Summary
מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.
Abstract
פרץ חימצוני או הנשימה משמש לתאר את צריכת החמצן מהירה ויצירת של מינים חמצן תגובתי (ROS) phagocytes בתגובה לגירויים שונים של מערכת החיסון. ROS שנוצר במהלך הפעלת המערכת החיסונית מפעילה פעילות מיקרוביאלית חזק בעיקר דרך היכולת של ROS נזק DNA, חלבונים, גרימת מוות של מיקרואורגניזמים. היכולת למדוד ROS ייצור reproducibly, בקלות הכרחי על מנת להעריך את התרומה של מסלולים שונים, מולקולות מנגנון ההגנה המארח. בנייר זה, אנו מדגימים את השימוש הגששים פלורסנט, flow cytometry לזהות ROS הייצור. למרות בשימוש נרחב, פלורסנט מדידה של ROS הוא מאד בעייתי, במיוחד בכל הנוגע מדידה של ROS שנגזרות לגירויים ספציפיים, לא mitogenic. אנו מציגים מתודולוגיה מפורט כדי לזהות ROS שנוצר בעקבות גירוי FcγR מסוים החל דור מקרופאג לקרקע, מכתים, FcγR cross-linking, סיום עם ניתוח תזרים cytometric.
Introduction
מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי או רדיקלים חופשיים, כי הם תוצר לוואי של נשימה אירובית (נבדקה ב 1). אלה כוללים את סופראוקסיד אניון, מי חמצן, מימן על-חמצני, רדיקלי הידרוקסיל ו יוני הידרוקסיל, בין היתר. בתנאים רגילים הפיזיולוגיות, ROS מיוצרים בעיקר על ידי המיטוכונדריה nicotinamide אדנין dinucleotide פוספט (ניקוטין) oxidases, הן במהירות מאושפרת על ידי אנזימים וחלבונים שונים כמו סופראוקסיד דיסמוטאז גלוטטיון. ייצור מוגזם ROS או פגם ביכולת להסיר ROS יכול לגרום סטרס חמצוני, לפיה מינים חמצן תגובתי לקדם את הנזק של חלבונים, ליפידים ו DNA שמוביל מתח סלולארית או מוות ועם מצבי מחלה פתולוגית. עם זאת, הוא מעריך כיום כי ROS יכול גם לפעול מולקולות איתות (חמצון-חיזור איתות), בתיווך ROS שינוי של מולקולות שונות שביל ביניים יכולים להשפיע על חילוף החומרים הסלולר, התפשטות, הישרדות, דלקתיות איתות, והתיישנות2. בתאים phagocytic, רוס ממלא תפקיד חיוני במתן פעילות מיקרוביאלית במהלך כביכול “פרץ הנשימה”1,3,4,5,6. במהלך התגובה של phagocytes לגירויים חיצוניים, מרכיבי אוקסידאז nadph ל מורכבים (p40phox, p47phox, p67phox) translocate מ ציטוזול למוח phagosomal המכילות את gp91phox ואת p22phox subunits, יחד עם הפעולות של Rac1/2, יוצרים מתפקדת במלואה nadph ל אוקסידאז האנזים מורכבים. אוקסידאז nadph ל שהורכב ואז מנצל nadph ל כדי לצמצם את החמצן סופראוקסיד בתוך חלולית phagosomal. סופראוקסיד אניונים ישירות יכול לגרום לנזק או להיות dismutated לתוך מימן על-חמצני. סופראוקסיד והן מימן על-חמצני יכול להגיב עם מולקולות אחרות ליצירת רדיקלים הידרוקסיל תגובתי. נזק מתווך התגובה של אלה ROS עם ברזל-גופרית אשכולות על חלבונים או על ידי גרימת חמצון הבסיס של ה-DNA, המוביל בסופו של דבר מוגבל מטבוליזם מיקרוביאלי או מוות של חיידק5. החשיבות של האנזים אוקסידאז nadph ל מורכבים של ROS המיוצרים במהלך הנשימה פרץ זה מודגם קלינית בחולים עם מחלת גרגירומת ממושכת כרונית (CGD)7,8,9, 10. אנשים עם CGD מחזיקים מוטציות בגן gp91phox, והתוצאה היא חוסר ייצור ROS, רגישות לזיהומים חוזרים ונשנים עם חיידקים ופטריות אשר אינם בדרך כלל בעיה עם immunocompetent יחידים. לכן, אם לומד חימצוני מתח, חמצון-חיזור איתות או הגנה המארח, להיות מסוגל למדוד ROS הייצור בזמן אמת הוא מאמץ שימושי.
כבר מנוצל מספר מבחני הפקה ROS מידה או בתוצאות של סטרס חמצוני11,12,13. בין אלה, אחד בשימוש נרחב ביותר הוא בדיקה פלורסנט 2′, 7′ dichlorodihydrofluorescein diacetate (2– DCFH DA)14. מולקולה זו הוא חסר צבע lipophilic. פעפוע של DCFH2-DA על פני קרום התא מאפשר לו להיות שכוונת מאת תאיים esterases, אשר deacetylates את זה לתוך DCFH2, טיוח זה תא אטום. הפעולות של מספר סוגים של ROS (מימן על-חמצני, peroxynitrite, הידרוקסיל רדיקלים, תחמוצת החנקן ו רדיקלים peroxy) DCFH2 נישחק זה לתוך DCF אשר פלורסנט (דיווח Ex / Em: 485-500 ננומטר/515-530 ננומטר), ניתן להבחין באמצעות זרם cytometer מצויד עם מסנן סטנדרטי עבור fluorescein (ערוץ FL1). סופראוקסיד אינו מגיב בחריפות עם DCFH2 אבל יכול להגיב עם dihydroethidium בדיקה נוספת (היא) להניב פלורסנט מוצר ה-2-hydroxyethidium (מוצרי פלורסנט סופראוקסיד תלויית חמצון יתר)15. המוצרים פלורסנט של חמצון היא שניתן לאתר באמצעות אורך גל של עירור של 518 ננומטר, אורך גל של פליטה של 605 ננומטר (ערוץ FL2). למרות פשוטה יחסית לשימוש, ניצול של אלה זונדי גילוי של ROS דורש ידע של המגבלות שלהם, תיאגוד זהיר מכתים תהליכים ובקרות לתוך וזמינותו מסוימת המבוצעת על מנת שיהיה תקף ניסיוני תוצאות ומסקנות. הפרוטוקול הבא מדגים את השימוש ערכת זמינים מסחרית העסקת אלה 2 רגשים שעיצב למדוד ROS cytometry זרימה. אנו כתם להתקפת מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם אלו הגששים, זירוז ייצור ROS באמצעות FcγR cross-linking. אנו להציג נציג נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה, הלחץ המתאים אמצעי זהירות זה חייב להתבצע עבור ניסויים מוצלחים.
Protocol
Representative Results
Discussion
DCFH2-DA ומבוסס-היא גילוי של ROS היא טכניקה נפוץ14,15. קלות שימוש והתאמה של אלה ROS זונדי תבניות microplate קינטי, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או זרימה cytometric ניתוח תרם הפופולריות שלהם. עם זאת, במחקרים שלנו של פונקציות מקרופאג בתיווך FcγR, שם לא נראה להיות פרוטוקול תק…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצה להודות חברים אחרים של המעבדה Tigno-ארנחואס כולל ומדלין ה. מילר, עומר קרדונה, Andjie Jeudy, Roopin סינג על עזרתם בתחזוקת המושבה האחזקה ועכבר מעבדה. תמיכה עבור מחקר זה סופק על ידי גרנט R00 HL122365 וקרנות סטארט-אפ J.T.T-איי
Materials
| Anti-BSA IgG1 | Innovative Research | IBSA9E2C2 | |
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400626 | |
| Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoethanol (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Jackson labs | Stock No.000664 | |
| CM-H2DCFDA | Molecular Probes | C6827 | Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit |
| Dihydroethidium (DHE) | Molecular Probes | D11347 | Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM no phenol red | Gibco | 31053-028 | |
| DMF Anhydrous | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| LADMAC cells | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| mouse IFN-g | GoldBio | 1360-06-100 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | EMD Milipore | 106425 | Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit |
| Novocyte flow cytometer with autosampler | Acea | 2060R | |
| Pyocyanin (ROS inducer) | Cayman chemical | 10009594 | Can be a substitute for inducer in the Enzo kit |
| ROS-ID total ROS/superoxide detection kit | ENZO | ENZ-51010 | |
| Sodium pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).
- Robinson, J. M. Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes. Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).
- Thomas, D. C. The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances. Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).
- Fang, F. C. Antimicrobial actions of reactive oxygen species. MBio. 2 (5), (2011).
- Iles, K. E., Forman, H. J. Macrophage signaling and respiratory burst. Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).
- Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease. New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).
- Good, R. A., et al. Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function. Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).
- Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function. Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).
- Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood. Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).
- Dikalov, S. I., Harrison, D. G. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).
- Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells. White Paper. , (2015).
- Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems. Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).
- Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy. Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments. Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).
