Summary

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

Published: March 02, 2019
doi:

Summary

Ce protocole permet la visualisation de l’expression génique dans embryonnaires agassizii Astyanax . Cette approche a été développée avec l’objectif de maximiser le signal d’expression de gène, tout en minimisant la coloration de fond non spécifique.

Abstract

Ces dernières années, un génome de projet pour les aveugles agassizii mexicain (Astyanax mexicanus) a été libéré, révéler l’identité de séquence pour des milliers de gènes. Des recherches antérieures dans ce nouveau système de modèle capitalisé sur les enquêtes de génome complets qui ont identifié plusieurs QTL (QTL) associé à divers phénotypes associés à la grotte. Toutefois, la possibilité de connecter des gènes d’intérêt à la base héréditaire de changement phénotypique demeure un défi important. Une technique qui peut faciliter une compréhension plus profonde du rôle du développement dans l’évolution de la troglomorphic est entier-montez l’hybridation in situ. Cette technique peut être implémentée pour directement comparer l’expression des gènes entre les formes vivant dans les grottes et surface, désigner candidat gènes qui sous-tendent les QTL établie, identifier des gènes d’intérêt provenant d’études de la nouvelle génération de séquençage ou développer autre approches axées sur la découverte. Dans ce rapport, nous présentons un protocole simple, accompagné d’une liste de contrôle flexible, qui peut être largement adapté pour une utilisation bien au-delà du système de l’étude présentée. Il est à espérer que ce protocole peut servir comme une grande ressource pour la communauté Astyanax et au-delà.

Introduction

Hybridation in situ est une méthode commune pour la coloration des tissus fixés pour visualiser gene expression patterns1. Cette technique a été réalisée pour années dans d’autres traditionnels2 et systèmes de modèles non traditionnels3 , pour une variété d’études biologiques. Cependant, plusieurs étapes et les réactifs sont nécessaires pour réaliser avec succès cette procédure. Pour les enquêteurs qui n’ont jamais fait cette technique, il peut être intimidant en raison des nombreuses étapes d’amorcer le processus. En outre, la nature longue de cette procédure se prête à des fautes techniques, qui peuvent être difficile à résoudre.

L’objectif général du présent article est de présenter une méthode simple et directe qui rendra cette technique d’hybridation accessible à un large public. Afin de réduire l’introduction d’erreurs, nous présentons une approche simple qui donne expression de gène de haute qualité coloration et minimise le signal de fond non spécifique. Cette procédure est similaire aux autres approches développées dans les systèmes de modèle traditionnel, comme le Danio rerio4. Ici, nous visons à faciliter l’application minutieuse de chaque étape à l’aide d’une liste téléchargeable (fichier supplémentaire 1), à promouvoir l’application minutieuse du protocole. La raison d’être pour ce faire est de faciliter l’organisation à travers les nombreuses étapes dans cette procédure. Cet article est approprié pour les chercheurs intéressés dans l’accomplissement entier-montez l’hybridation in situ dans le développement des embryons, mais n’ont pas encore effectué la procédure. L’avantage de l’approche choisie pour Astyanax chercheurs est qu’il a été testé et prouvé en agassizii et morphes de poissons de surface, ce qui facilite les analyses comparatives d’expression. La méthode présentée peut être utilisée par des chercheurs en études sur les autres systèmes et Astyanax .

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Cincinnati (protocole n° 10-01-21-01). 1. la fixation Isoler le nombre désiré d’Astyanax mexicanus embryons provenant d’un réservoir d’élevage et difficulté ~ 50 embryons à la fois. Si les embryons sont grandes et anciennes, il peut être nécessaire de fixer les 25 à la fois pour assurer la fixation même. Selo…

Representative Results

Dans ce rapport, nous proposons une approche simple et directe pour effectuer le marquage des spécimens d’Astyanax embryonnaires pour l’analyse de l’expression génique de haute qualité. Cette technique peut être effectuée dans les quatre ou cinq jours, et chaque étape principale de la procédure est représenté dans un diagramme de flux codés par couleur (Figure 1). Une fois terminé, embryons colorés devraient abriter une étiquette c…

Discussion

En raison de la vulnérabilité de l’ARN à la dégradation, une des étapes plus critiques dans le protocole porte sur la synthèse stérile de la sonde d’ARN. Toutefois, si une sonde est générée avec soin et donne de bons résultats, il peut être réutilisé dans des réactions subséquentes de coloration. Une seconde étape cruciale est la production minutieuse de tous les réactifs utilisés tout au long du protocole. Ce protocole implique plusieurs jours et nombreuses petites étapes, il est essentiel que to…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire brut des commentaires utiles sur ce manuscrit. Nous tenons à souligner quatre lycéens qui utilise ce protocole au cours de stages d’été en 2017 et 2018, dont Christine Cao, Michael Warden, Aki Li et David Nwankwo. HL était soutenue par une bourse de recherche de souches de biologie UC pendant l’été de 2017. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DEB-1457630 de JBG) et le National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH ; DE025033 à JBG).

Materials

10 mL Serological Pipette VWR 89130-888
1000 mL Filtration Unit VWR 89220-698
15 mL Conical VWR-Greiner 82050-278
25 mL Serological Pipette VWR 89130-890
250 mL Filtration Unit VWR 89220-694
5 mL Serological Pipette VWR 89130-886
50 mL Conical VWR-Falcon 21008-940
500 mL Filtration Unit VWR 89220-696
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma-Roche 11093274910
BCIP Sigma-Aldrich B8503-1G 1 g
Blocking Solution Sigma-Roche 11 096 176 001 50 g
Citric Acid Fisher Scientific A104-500 500 g
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Sigma-Roche 11175025910
Eppendorf Tubes VWR 20170-577
Ethanol Fisher-Decon 04-355-223 1 Gal
Formamide Thermo Fisher Scientific 17899 100 mL
Glass dram vials VWR 66011-041 1 Dr
Glass Pipettes Fisher Scientific 13-678-8A
HCl Thermal-ScientificPharmco-AAPER 284000ACS 500 mL
Heparin Sigma H3393-25KU
Magnesium Chloride-crystalline Fisher Scientific M33-500 500 g
Maleic Acid Sigma M0375-100g 100g
Methanol Fisher Scientific A452-4 4L
Molecular-grade Water (RNase-free) VWR 7732-18-5 500 mL
NaCl Fisher Scientific S271-3 3 kg
NaOH pellets Fisher Scientific S318-500 500 g
NBT Substrate powder ThermoFisher Scientific 34035 1 g
Normal Goat Serum Fisher-Invitrogen 31873
Nutating Mixer VWR 82007-202
Paraformaldehyde Sigma 158127-500g 500 g
PBS 10x Fisher Scientific BP399-20 20L
Proteinase K (200mg/10ml) Qiagen 19133 10 mL
Plastic Pipettes VWR-Samco 14670-147
RNAse Sigma R2020-250mL 250 mL
Shaking Water Bath 12 L VWR 10128-126 12 L
Standard Analog Shaker VWR 89032-092
Tris Sigma Millipore-OmniPur 9210-500GM 500 g
tRNA Yeast Fisher-Invitrogen 15401011 25 mg
Tween 20 Sigma P9416-50mL 50 mL
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc 50-728-002
Lithium Chloride (LiCl) Sigma-Aldrich 203637-10G 10 g

Referências

  1. Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
  2. Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
  3. Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
  4. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
  5. Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
  6. Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
  7. Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
  8. Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
  9. Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
  10. Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
  11. Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
  12. Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
  13. Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
check_url/pt/59114?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Luc, H., Sears, C., Raczka, A., Gross, J. B. Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos. J. Vis. Exp. (145), e59114, doi:10.3791/59114 (2019).

View Video