Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax
Summary
פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של ביטוי גנים בעובריים Astyanax cavefish. גישה זו פותחה במטרה למקסם את אות של ביטוי גנים, תוך מזעור צביעת הרקע לא ספציפית.
Abstract
בשנים האחרונות, גנום טיוטה עבור מקסיקני עיוור cavefish (Astyanax mexicanus) שוחררה, לחשוף את זהותם רצף אלפי גנים. מחקר קודם במערכת מודל המתעוררים הזאת באותיות רישיות על חקירות הגנום כולו מקיף זיהו אינספור אתרים תכונה כמותית כמותיים המשויך פנוטיפים שונים הקשורים המערה. עם זאת, היכולת להתחבר הגנים של ריבית הבסיס heritable לשינוי פנוטיפי נשאר אתגר משמעותי. טכניקה אחת זה יכול להקל על הבנה עמוקה יותר של התפקיד של פיתוח באבולוציה troglomorphic הוא היברידיזציה כולה-הר. ניתן ליישם טכניקה זו כדי להשוות בין גנים בין המערה – ואת משטח המגורים טפסים, למנות מועמד גנים שבבסיס QTL הוקמה, לזהות את הגנים של עניין ממחקרים הדור הבא רצפי או לפתח את זה ישירות גישות מבוססות-גילוי. בדו ח זה, אנו מציגים פרוטוקול פשוט, הנתמך על-ידי רשימת תיוג גמיש, אשר ניתן להתאים באופן נרחב לשימוש הרבה מעבר למערכת המחקר הציג. יש לקוות כי פרוטוקול זה יכול לשמש משאב רחבה למען הקהילה Astyanax ומעבר.
Introduction
היברידיזציה באתר היא שיטה נפוצה עבור צביעת רקמות קבוע להמחיש דפוסי ביטוי גנים1. טכניקה זו בוצעה שנים אחרים מסורתי2 שגרתיים3 דגם מערכות, למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים. עם זאת, מספר צעדים, ריאגנטים נחוצים לבצע הליך זה בהצלחה. עבור חוקרים אשר מעולם לא ביצע בטכניקה זו, מפעיל את התהליך יכולה להיות מאיימת בשל הצעדים רבים הכרוכים עוד יותר, מהות ההליך ממושך משאיל את עצמו על שגיאות טכניות, אשר עשויה להיות מאתגרת כדי לפתור בעיות.
המטרה הכוללת של מאמר זה היא להציג שיטה פשוטה שיעבד טכניקה זו הכלאה נגיש לקהל רחב. כדי לצמצם את המבוא של שגיאות, אנו מציגים בגישה ישירה התשואות באיכות גבוהה ג’ין ביטוי מכתים, ממזער את האות רקע שאינם ספציפיים. הליך זה דומה גישות אחרות שפותחה במערכות דגם מסורתיים, כגון רזבורה rerio4. כאן, אנו שואפים לקדם יישום זהיר של כל שלב באמצעות רשימת פעולות לביצוע להורדה (1 קובץ משלים), כדי לקדם את יישום זהיר של הפרוטוקול. הרציונל לביצוע פעולה זו היא להקל על הארגון בשלבים רבים הכרוכים בהליך זה. מאמר זה מתאים מהחוקרים המעוניינים בביצוע היברידיזציה כולה-הר בפיתוח עוברי, אך עדיין לא ביצעתי את ההליך. היתרון של הגישה שבחרת עבור חוקרים Astyanax הוא כי זה יש נבדק והוכח cavefish והן morphs דגים השטח, ובכך להקל ביטוי השוואתי ניתוחים. ניתן להשתמש בשיטת שהוצגו על ידי חוקרים מחקרים על Astyanax ומערכות אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשל הפגיעות של RNA כדי השפלה, אחד הצעדים הקריטיים ביותר בפרוטוקול נוגע הסינתזה סטרילי של החללית ה-RNA. עם זאת, אם בדיקה מופק היטב, מספק תוצאות טובות, זה יכול לעשות שימוש חוזר בתגובות מכתימים עוקבות. צעד מכריע השני הוא ייצור זהיר של כל ריאגנטים בשימוש בכל רחבי בפרוטוקול. מאז פרוטוקול זה כרוך מספ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות חברי המעבדה ברוטו עבור הערות מועילות על כתב היד הזה. ברצוננו להודות ארבעה תלמידי תיכון אשר מנוצל פרוטוקול זה במהלך התמחות קיץ בחודשים 2017 2018, לרבות כריסטין סאו, מייקל וורדן, אקי Li נוואנקוו דוד. HL נתמכה על ידי מלגת UC ביולוגיה גזע במהלך קיץ 2017. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הקרן הלאומית למדע (דב-1457630 כדי JBG), נבחרת מוסדות של שיניים ואת ואסטתיים מחקר (NIH; DE025033 אל JBG).
Materials
| 10 mL Serological Pipette | VWR | 89130-888 | |
| 1000 mL Filtration Unit | VWR | 89220-698 | |
| 15 mL Conical | VWR-Greiner | 82050-278 | |
| 25 mL Serological Pipette | VWR | 89130-890 | |
| 250 mL Filtration Unit | VWR | 89220-694 | |
| 5 mL Serological Pipette | VWR | 89130-886 | |
| 50 mL Conical | VWR-Falcon | 21008-940 | |
| 500 mL Filtration Unit | VWR | 89220-696 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma-Roche | 11093274910 | |
| BCIP | Sigma-Aldrich | B8503-1G | 1 g |
| Blocking Solution | Sigma-Roche | 11 096 176 001 | 50 g |
| Citric Acid | Fisher Scientific | A104-500 | 500 g |
| DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) | Sigma-Roche | 11175025910 | |
| Eppendorf Tubes | VWR | 20170-577 | |
| Ethanol | Fisher-Decon | 04-355-223 | 1 Gal |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific | 17899 | 100 mL |
| Glass dram vials | VWR | 66011-041 | 1 Dr |
| Glass Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-8A | |
| HCl | Thermal-ScientificPharmco-AAPER | 284000ACS | 500 mL |
| Heparin | Sigma | H3393-25KU | |
| Magnesium Chloride-crystalline | Fisher Scientific | M33-500 | 500 g |
| Maleic Acid | Sigma | M0375-100g | 100g |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | 4L |
| Molecular-grade Water (RNase-free) | VWR | 7732-18-5 | 500 mL |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | 3 kg |
| NaOH pellets | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| NBT Substrate powder | ThermoFisher Scientific | 34035 | 1 g |
| Normal Goat Serum | Fisher-Invitrogen | 31873 | |
| Nutating Mixer | VWR | 82007-202 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500g | 500 g |
| PBS 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 20L |
| Proteinase K (200mg/10ml) | Qiagen | 19133 | 10 mL |
| Plastic Pipettes | VWR-Samco | 14670-147 | |
| RNAse | Sigma | R2020-250mL | 250 mL |
| Shaking Water Bath 12 L | VWR | 10128-126 | 12 L |
| Standard Analog Shaker | VWR | 89032-092 | |
| Tris | Sigma Millipore-OmniPur | 9210-500GM | 500 g |
| tRNA Yeast | Fisher-Invitrogen | 15401011 | 25 mg |
| Tween 20 | Sigma | P9416-50mL | 50 mL |
| Vortex-Genie 2 | Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc | 50-728-002 | |
| Lithium Chloride (LiCl) | Sigma-Aldrich | 203637-10G | 10 g |
Referências
- Valentino, K. L., Eberwine, J. H., Barchas, J. D. . In situ hybridization: Application to neurobiology. , (1987).
- Mugrauer, G., Alt, F. W., Ekblom, P. N-myc proto-oncogene expression during organogenesis in the developing mouse as revealed by in situ hybridization. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1325-1335 (1988).
- Kerney, R., Gross, J. B., Hanken, J. Early cranial patterning in the direct‐developing frog Eleutherodactylus coqui revealed through gene expression. Evolution & Development. 12 (4), 373-382 (2010).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Cheung, M., Briscoe, J. Neural crest development is regulated by the transcription factor Sox9. Development. 130 (23), 5681-5693 (2003).
- Knight, R. D., Nair, S., Nelson, S. S., Afshar, A., Javidan, Y., Geisler, R., Rauch, G. J., Schilling, T. F. lockjaw encodes a zebrafish tfap2a required for early neural crest development. Development. 130 (23), 5755-5768 (2003).
- Yang, J. W., Jeong, B. C., Park, J., Koh, J. T. PHF20 positively regulates osteoblast differentiation via increasing the expression and activation of Runx2 with enrichment of H3K4me3. Scientific Reports. 7 (1), 8060 (2017).
- Ganju, R. K., Brubaker, S. A., Meyer, J., Dutt, P., Yang, Y., Qin, S., Newman, W., Groopman, J. E. The α-chemokine, stromal cell-derived factor-1α, binds to the transmembrane G-protein-coupled CXCR-4 receptor and activates multiple signal transduction pathways. Journal of Biological Chemistry. 273 (36), 23169-23175 (1998).
- Cai, Y., Xin, X., Yamada, T., Muramatsu, Y., Szpirer, C., Matsumoto, K. Assignments of the genes for rat pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (Adcyap1) and its receptor subtypes (Adcyap1r1, Adcyap1r2, and Adcyap1r3). Cytogenetic and Genome Research. 71 (2), 193-196 (1995).
- Stolt, C. C., Rehberg, S., Ader, M., Lommes, P., Riethmacher, D., Schachner, M., Bartsch, U., Wegner, M. Terminal differentiation of myelin-forming oligodendrocytes depends on the transcription factor Sox10. Genes & Development. 16 (2), 165-170 (2002).
- Kimura, T., Takehana, Y., Naruse, K. pnp4a is the causal gene of the Medaka Iridophore mutant guanineless. G3: Genes, Genomes, Genetics. 7 (4), 1357-1363 (2017).
- Monsoro-Burq, A. H. A rapid protocol for whole-mount in situ hybridization on Xenopus embryos. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4809 (2007).
- Schulz, C. In situ hybridization to Drosophila testes. Cold Spring Harbor Protocols. (8), pp.pdb-prot4764 (2007).
