Retrograd transport av proteiner fra celleoverflaten til Golgi er avgjørende for å opprettholde membran homeostase. Her beskriver vi en metode for å analysere biokjemisk cellen overflaten til Golgi transport av rekombinante proteinene bruke functionalized nanobodies i HeLa celler.
Transport av proteiner og membraner fra celleoverflaten av Golgi og utover er nødvendig for homeostase, organelle identitet og fysiologi. For å studere retrograd protein trafikk, har vi nylig utviklet en allsidig nanobody-baserte verktøykasse for å analysere fra celleoverflaten transport til Golgi komplekset, enten ved faste og levende celle imaging elektronmikroskop, eller biokjemisk. Vi utviklet functionalized anti-grønn fluorescerende protein (GFP) nanobodies-liten, monomerisk, høy affinitet protein bindemidler, som kan brukes på linjer uttrykke membran proteiner av interesse med en ekstracellulære GFP moiety. Derivatized nanobodies bundet til GFP journalister er spesielt internalisert og transportert piggyback langs journalister sortering ruter. Nanobodies var functionalized med fluorophores å følge retrograd transport av fluorescens mikroskopi og live bildebehandling, med ascorbate peroxidase 2 (APEX2) for å undersøke den ultrastructural lokaliseringen av reporter-nanobody komplekser av elektron mikroskopi, og med tyrosin sulfation (TS) motiver å vurdere kinetics trans-Golgi nettverk (TGN) ankomst. I denne metodologiske artikkelen skissere vi de generelle fremgangsmåten for å bacterially express og rense functionalized nanobodies. Vi illustrerer kraftig bruk av våre verktøy bruker mCherry – og TS-endret nanobodies å analysere endocytic opptak og TGN ankomsten av Last proteiner.
Retrograd trafikk proteiner og lipider fra celleoverflaten til ulike intracellulær rom er avgjørende for vedlikehold av membran homeostase motvekt sekresjon og resirkulere komponenter i anterograd transport machineries1 , 2. etter internalisering via clathrin-avhengige eller -uavhengig endocytose, protein og lipid Last først fylle tidlig endosomes fra der de er ytterligere Omdirigert enten langs endo-lysosomale systemet, resirkulert til plasma membranen, eller målrettet trans-Golgi nettverket (TGN). Resirkulering fra endosomes og/eller celleoverflaten til TGN er en del av funksjonelle syklusen av en rekke anterograd transmembrane Last reseptorer, som kasjon-avhengig og uavhengig av cation mannose-6-fosfat receptors (CDMPR og CIMPR) levere nylig syntetisert lysosomale hydrolases fra TGN sent endosomes og lysosomer3,4,5, sortilin og SorLA6,7og Wntless (WLS) transport Wnt ligander til celleoverflaten 8 , 9 , 10 , 11. andre proteiner hentet tilbake til TGN er TGN46 og dens relaterte isoformene12,13,14, snarer (løselig N– ethylmaleimide-sensitive fusion faktor vedlegg reseptorer) 15 , 16 , 17, amyloid forløper protein (APP)18,19, progressiv ankylosis (ANK) protein20, metall transportører som ATP7A/B eller DMT121,22, og transmembrane behandler enzymer inkludert karboksypeptidase D, furin eller BACE123,24,25. Bortsett fra disse endogene proteiner kapre bakteriell og plante giftstoffer (f.eks Shiga og kolera gift, Risin og abrin) retrograd transport machineries å nå ER for retrotranslocation i stoffer26,27, 28,29.
For å direkte analysere retrograd trafikk, har vi utviklet et nanobody-baserte verktøysett for å merke og følg Last proteiner fra celleoverflaten til intracellulær rom30. Nanobodies representerer en ny familie av protein bindemidler avledet fra homodimeric tunge-kjede-bare antistoffer (hcAbs) som naturlig oppstår i camelids og cartilaginous fisker31,32. De utgjør variabel tunge-kjeden domenet (VHH) av hcAbs og har mange fordeler fremfor konvensjonelle antistoffer (f.eks IgGs): de er monomerisk, liten (~ 15 kDa) svært løselig, uten disulfide obligasjoner, kan bacterially uttrykt og valgt for høy affinitet bindende33,34,35,36. For å gjøre våre nanobody verktøyet allsidig og bredt aktuelt, ansatt vi functionalized anti-GFP nanobodies overflaten-etikett og spore proteiner merket med GFP på deres ekstracellulære/lumenal domene. Ved functionalization av nanobodies med mCherry, ascorbate peroxidase 2 (APEX2)37eller tyrosin sulfation (TS) sekvenser, retrograd transport av bonafide transmembrane Last proteiner kan analyseres av enten fast og lever celle bildebehandling, av elektronmikroskop, eller biokjemisk. Siden tyrosin sulfation formidlet av tyrosylprotein sulfotransferases (TPST1 og TPST2) er en posttranslational endring begrenset til trans-Golgi/TGN, kan vi direkte studere transport og kinetics proteiner av interesse fra celleoverflaten til dette intracellulær Golgi kupé38,39,40.
I denne metoder artikkelen beskriver vi enkel produksjon av functionalized nanobodies (VHH-2xTS-APEX2, – mCherry og derivater) egnet for en rekke programmer til å analysere retrograd transport i pattedyrceller30. We fokusere hovedsakelig på bruk av TS området endret nanobody for analyse av intracellulær trafikk fra celleoverflaten sulfation-rommet.
Nanobodies representerer en ny klasse av protein dokumentordner stillaser med mange fordeler fremfor konvensjonelle antistoffer: de er små, stabil, monomerisk, kan velges for høy affinitet og mangel disulfide obligasjoner33,35, 44 , 45. de brukes i en rekke programmer, slik som i celle kultur systemer og organismer utviklingsbiologi46,47</s…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Grant 31003A-162643 av Swiss National Science Foundation. Vi takker Nicole Beuret og den Biozentrum Imaging Core anlegg (IMCF) for støtte.
Anti-GFP antibody | Sigma-Aldrich | 118144600001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Anti-His6 antibody | Bethyl Laboratories | A190-114A | |
Anti-actin antibody | EMD Millipore | MAB1501 | |
Goat anti-rabbit HRP | Sigma-Aldrich | A-0545 | |
Goat anti-mouse HRP | Sigma-Aldrich | A-0168 | |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | dissolved in 1 x PBS/1%BSA |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Applichem | A3672 | |
D-biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | dissolved in sterile 500 mM NaH2PO4 or DMSO |
5-aminolevuilnic acid (dALA) hydrochloride | Sigma-Aldrich | A3785 | dissolved in sterile water |
DNase I | Applichem | A3778 | dissolved in sterile water |
Lysozyme | Sigma-Aldrich | 18037059001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Brefeldin A (BFA) | Sigma-Aldrich | B5936 | |
Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
Penicillin/Streptomycin | Bioconcept | 4-01F00-H | |
L-glutamine | Applichem | A3704 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biowest | S181B-500 | |
Sulfur-35 as sodium sulfate | Hartmann Analytics | ARS0105 | Product contains 5 mCi |
Earle's balanced salts | Sigma-Aldrich | E6267 | |
MEM amino acids (50 x) solution | Sigma-Aldrich | M5550 | |
MEM vitamin solution (100 x) | Sigma-Aldrich | M6895 | |
cOmplete, Mini Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836153001 | Product is distributed by Sigma-Aldrich, but manufactured by Roche |
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) | Applichem | A1008 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Carbenicillin disodium salt | Applichem | A1491 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
Kanamycin sulfate | Applichem | A1493 | dissolved in sterile water, stock is 100 mg/mL |
Coomassie-R (Brilliant Blue) | Sigma-Aldrich | B-0149 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Applichem | A3813 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Ni Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-5268-01 | |
His GraviTrap columns | GE Healthcare | GE11-0033-99 | |
His buffer kit | GE Healthcare | GE11-0034-00 | |
Disposable PD10 desalting columns | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
Mini-Protean TGX gels, 4-20%, 15-well | Bio-Rad | 456-1096 | |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) w/o Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537 | |
35-mm dishes | Falcon | 353001 | |
6-well plates | TPP | 92406 | |
Glass coverslips (No. 1.5H) | VWR | 631-0153 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Applichem | A0999.0025 | dissolved in 40% DMSO 60% isopropanol, stock in 500 mM |
Tryptone | Applichem | A1553 | |
Yeast extract | Applichem | A1552 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 105833 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 102382 | dissolved in sterile water, stock is 1 M |
Sodium chloride | Merck Millipore | 106404 | dissolved in sterile water, stock is 5 M |