Summary

Gedrags Tracking en Neuromast beeldvorming van Mexicaanse Cavefish

Published: April 06, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we methoden voor high-throughput onderzoek naar een reeks van de Mexicaanse cavefish gedrag en vitale kleuring van een mechanosensory systeem. Deze methoden maken gebruik van vrije-software en op maat gemaakte scripts, bieden een praktische en kosteneffectieve methode voor de studie van gedrag.

Abstract

Grot-woning dieren geëvolueerd uit een reeks van morfologische en gedrags eigenschappen aan te passen aan hun permanent donker en voedsel-sparse omgevingen. Onder deze eigenschappen is foerageren gedrag een van de nuttige windows in functionele voordelen van gedrags trait evolutie. Hierin gepresenteerd zijn bijgewerkte methoden voor het analyseren van de attractie trillingsgedrag (VAB: een adaptieve foerageren gedrag) en imaging van bijbehorende mechanosensors van grot-aangepast tetra, Astyanax mexicanus. Daarnaast zijn methoden voor high-throughput bijhouden van een aantal extra cavefish gedrag met inbegrip van hyperactiviteit en slaap-verlies gepresenteerd. Cavefish Toon ook asocialiteit, repetitief gedrag en hogere angst. Daarom, cavefish dienen als een dierlijk model voor geëvolueerd gedrag. Deze methoden maken gebruik van vrije-software en op maat gemaakte scripts die kunnen worden toegepast op andere soorten gedrag. Deze methoden praktisch en kostenbesparend alternatieven bieden voor verkrijgbare opsporingssoftware.

Introduction

De Mexicaanse tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), is uniek onder de vissen voor het feit dat twee radicaal verschillende alternatieve morphs – een morph slechtzienden, oppervlakte-woning en een blinde, grot-woning morph bestaat uit verschillende afzonderlijke bevolking:1. Hoewel verschillend in de morfologie en fysiologie, zijn ze nog steeds interfertile2,3. Deze interfertile morphs lijken te snel (~ 20.000 jaar)4, waardoor ze een ideale modelsysteem voor de studie van snelle aanpassing geëvolueerd. Cavefish is bekend dat er een suite van uiteenlopende morfologische en gedrags eigenschappen met inbegrip van grotere dichtheid van de smaakpapillen, toegenomen aantal mechanosensors, foerageren gedrag afgestemd op een bepaalde frequentie van een trillend stimulus, hyperactiviteit, en slapeloosheid. Veel van deze problemen waarschijnlijk geëvolueerd gelijktijdig, waarvan sommige hebben gesuggereerd gunstig in de duisternis van de grotten voor foerageren5 en behoud van energie in de donkere en voedsel-sparse omgevingen6,7.

In vele evolutionaire modelsystemen is het moeilijk te verwerven van geïntegreerde kennis over hoe dieren morfologie en gedrag veranderen in antwoord op het milieu, omdat de meeste soorten zijn verdeeld over een continu verloop in complexe omgevingen. Het schril contrast tussen de grot en de oppervlakte morph Astyanax die geëvolueerd in zeer uiteenlopende omgevingen afgebakend door een scherpe ecotone heeft echter geleid tot Astyanax ontpopt zich als een uitstekend model om dierlijke evolutie te begrijpen. Dit maakt het mogelijk maken gemakkelijker genen en ontwikkelings processen met adaptieve karaktertrekken en selectie in de omgeving. Bovendien heeft de recente biomedisch onderzoek van deze eigenschappen in Astyanax aangetoond dat deze eigenschappen kunnen parallel menselijke symptomen8,9,10. Bijvoorbeeld zijn verlies van socialiteit en slaap, en aanwinst van hyperactiviteit, repetitief gedrag en cortisol niveau vergelijkbaar met wat is waargenomen bij de mens met autisme spectrum stoornis8.

Om aan te pakken de complexe Co-evolutie van veel gedragingen en morfologische kenmerken, is het voordelig om velen van hen wil onderliggende genetische en moleculaire pathways assay. Hierin gepresenteerd zijn methoden voor het karakteriseren van de mate van grot-type gedrags fenotypes van oppervlak, grot, en hybride morphs van Astyanax. De focal gedrag geanalyseerd om te karakteriseren fenotype zijn grot-aangepast foerageren gedrag (attractie trillingsgedrag, genoemd voortaan VAB) en hyperactiviteit/slaap duur11,12. Ook gepresenteerd, is een imaging methode voor het zintuigstelsel VAB13zijn gekoppeld. Onlangs, zijn veel open-source tracking software voor het uitvoeren van gedrags assays beschikbaar14,15geworden. Deze werken heel goed voor korte video’s, op minder dan 10 minuten lang. Nochtans, wordt het problematisch als de video langer vanwege de tijd van de intensief berekening/bijhouden is. Staat verkrijgbare software kunnen duur zijn. De methoden gepresenteerd hoofdzakelijk gebruik van freeware en daarom worden beschouwd als kosteneffectieve en high-throughput methoden. Ook inbegrepen zijn representatieve resultaten op basis van deze methoden.

Protocol

Alle procedures worden uitgevoerd volgens de richtlijnen beschreven in “Beginselen van Laboratory Animal Care” (National Institute of Health publicatie nr. 85-23, herzien 1985) en de goedgekeurde door de Universiteit van Hawaï in Manoa institutionele Animal Care en gebruik Comité dierlijke protocol 17-2560-3. 1. trillingen attractie gedrag (VAB) assay (≤ 10 min. voor volledige opname procedure) Opmerking: Gebruik een infrarood gevoelige camera of een infrarood cam…

Representative Results

De hier vermelde resultaten zijn representatieve voorbeelden van wat kan worden verkregen met de gepresenteerde methoden. Resultaten kunnen daarom afwijken iets van degene die hier gepresenteerd voor zowel cavefish en oppervlakte vissen afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Attractie trillingsgedrag Representatieve resultaten voor VAB kunnen…

Discussion

Deze voorgestelde methoden zijn gemakkelijk te bereiken maar kunnen ingewikkeld om uit te voeren vanwege de aard van zijn freeware oorsprong. Daarom is het sterk aanbevolen om het proces testen en analyses voor een werkelijke experimenten uit te voeren.

Het tarief van gegevens generatie kunnen snelle zodra het experimentele en analytische kader worden vastgesteld. Zodra vastgesteld, is het mogelijk record twee vis in 7 min voor de VAB-assay, 30 vis in 24 uur voor de activiteit/slaap assay en ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij danken alle leden van de Yoshizawa lab met inbegrip van N. Cetraro, N. Simon C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato en I. Lord voor vis verzorging op de experimentele vis gebruikt in dit manuscript. Wij danken ook A. Keene lab leden met inbegrip van P. Mašek om te trainen mijn te monteren IR CCD-camera. Tot slot bedank we het Media Lab – College voor sociale wetenschappen – School of Communications aan de Universiteit van Hawaï Mānoa voor hun onschatbare hulp bij het maken van de video, vooral B. Smith, J. Lam en S. White. Dit werk werd gesteund door Hawaiian Gemeenschap Foundation (16CON-78919 en 18CON-90818) en nationaal instituut van gezondheid NIGMS (P20GM125508) geeft aan MY.

Materials

4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) MilliporeSigma D3418
880 nm wave length black light Advanced Illumination BL41192-880
avfs freeware Version 1.0.0.6 http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth freeware Version 2.6.0 http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin freeware Version 2.11.0 https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) Corning 3140-100 10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT Noldus Information  Technology, Wageningen, The Netherlands Version 14 https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black Jardin (through Amazon.com) NA Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs Brine shrimp direct BSEA16Z
ImageJ freeware Version 1.52e https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens Toyo NA Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator Seachem NA
Optical cast plastic IR long-pass filter Edmund optics 43-948 Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap freeware Build 178 http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt Instant Ocean RC15-10
SwisTrack freeware Version 4 https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) Microsoft Q2F-00013 Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation freeware Version 8 https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system Microsoft 7, 8 or 10 https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw freeware NA https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

Referências

  1. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  2. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).
  3. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) – Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  4. Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
  5. Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  6. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
  8. Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
  9. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
  11. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
  12. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  13. Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Biologia do Desenvolvimento. 441 (2), 262-271 (2018).
  14. Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
  15. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  16. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
  17. Lee, A. . Virtualdub. , (2014).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
  20. Swimmer, B., Lang, H. H. . Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).
  21. Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. . Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).
  22. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
  23. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  24. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  25. Rasband, W. S. . Object Tracker. , (2000).
  26. Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , (2012).
  27. Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. . SwisTrack. , (2008).
check_url/pt/59099?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Worsham, M., Fernandes, V. F. L., Settle, A., Balaan, C., Lactaoen, K., Tuttle, L. J., Iwashita, M., Yoshizawa, M. Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59099, doi:10.3791/59099 (2019).

View Video