Beteendemässiga spårning och Neuromast avbildning av mexikanska släktet
Summary
Här presenterar vi metoder för hög genomströmning studie av en serie av den mexikanska släktet beteenden och vitala färgning av ett mechanosensory system. Dessa metoder använder fri programvara och skräddarsydda skript, som ger en praktisk och kostnadseffektiv metod för att studera beteenden.
Abstract
Grottboende djur har utvecklats en rad morfologiska och beteendemässiga egenskaper anpassas till deras ständigt mörka och mat-sparse miljöer. Bland dessa egenskaper är födosökande beteende en av de användbara windows in funktionella fördelar av beteendemässiga drag evolution. Presenteras häri är uppdaterade metoder för att analysera vibrationer attraktion beteende (VAB: ett adaptivt födosökande beteende) och bildbehandling av associerade mechanosensors grotta anpassad Tetra, Astyanax mexicanus. Dessutom presenteras metoder för hög genomströmning spårning av en rad ytterligare släktet beteenden inklusive hyperaktivitet och sömn-förlust. Släktet visar också antisocialt beteende, repetitivt beteende och högre ångest. Därför tjäna släktet som en djurmodell för utvecklade beteenden. Dessa metoder använder fri programvara och skräddarsydda skript som kan tillämpas på andra typer av beteende. Dessa metoder ger praktiska och kostnadseffektiva alternativ till kommersiellt tillgänglig mjukvara.
Introduction
Den mexikanska tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), är unik bland fiskar för att ha två radikalt olika alternativa morphs – en seende, surface-bostad morph och en blind, grottboende morph består av flera olika populationer1. Även olika i morfologi och fysiologi, är de fortfarande cannabiskonsumtion2,3. Dessa cannabiskonsumtion morphs verkar ha utvecklats snabbt (~ 20.000 år)4, vilket gör dem ett perfekt modellsystem för att studera snabb anpassning. Släktet är kända för att ha en svit av avvikande morfologiska och beteendemässiga egenskaper inklusive ökad täthet av smaklökar, ökat antal mechanosensors, födosökande beteende inställd på en viss frekvens av en vibrerande stimulans, hyperaktivitet och sömnlöshet. Många av dessa beteenden som sannolikt utvecklats samtidigt, varav vissa har föreslagits vara fördelaktiga i mörkret av grottor för födosök5 och bevara energi i mörka och mat-sparse miljöer6,7.
I många evolutionära modellsystem är det svårt att förvärva integrerad kunskap om hur djurs morfologi och beteende förändring svar på miljön eftersom de flesta arter är fördelade över en kontinuerlig gradient i komplexa miljöer. I skarp kontrast mellan grotta och ytan morph Astyanax som utvecklats i starkt kontrasterande miljöer som avgränsas av en skarp ecotone har dock lett till Astyanax växer fram som en utmärkt modell att förstå djurens evolution. Detta gör det möjligt att lättare koppla gener och utvecklingsprocesser med adaptiva egenskaper och urval i miljön. Senaste biomedicinska undersökningar av dessa egenskaper i Astyanax har dessutom visat att dessa egenskaper kan parallella mänskliga symtom8,9,10. Till exempel liknar förlust av socialitet och sömn, och vinst av hyperaktivitet, repetitivt beteende och kortisolnivå vad som observerats hos människor med autism spectrum disorder8.
För att lösa komplexa co utvecklingen av många beteenden och morfologiska drag, är det fördelaktigt att assay många av dem att lyfta fram underliggande genetiska och molekylära vägar. Presenteras häri finns metoder för att karakterisera graden av grottan-typ beteendemässiga fenotyper av ytan, grottan och hybrid morphs av Astyanax. De fokala beteenden analyseras för att karakterisera fenotyp är grottan-anpassad födosökande beteende (vibration attraktion beteende, hädanefter kallad VAB) och hyperaktivitet/sömn varaktighet11,12. Presenterade också är en tänkbar metod för det sensoriska systemet som är associerad med VAB13. Nyligen, många öppen mjukvara för kör beteendemässiga analyser har blivit tillgängliga14,15. Dessa fungerar mycket väl för korta videor, mindre än 10 minuter lång. Dock blir det problematiskt om videon är längre på grund av intensiv uträkningen/spårning tid. Kan inköpt programvara kan vara dyra. De metoder som presenteras använda främst freeware och därför anses vara kostnadseffektiva och hög genomströmning metoder. Ingår också är representativa resultat baserade på dessa metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dessa presenteras metoder är lätt-till-access men kan vara komplicerat att utföra på grund av dess freeware ursprung. Det rekommenderas därför starkt att utföra rättegång analyser och analyser innan några verkliga experiment.
Data generation kan vara snabb när den experimentella och analytiska ramen är etablerade. När etablerade, är det möjligt att spela in två fiskar i 7 min för VAB analysen, 30 fisk i 24 h för aktivitet/sleep analysen och en fisk i 2,5-3 min för neuromast …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla medlemmar för Yoshizawa lab inklusive N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato och I. Herren för fisk vård på experimentell fisk som används i detta manuskript. Vi tackar också A. Keene lab medlemmar inklusive s. Masek för att träna min att montera IR CCD-kamera. Slutligen vill vi tacka Media Lab – College of Social Sciences – skola av kommunikationerna på den University of Hawaii Mānoa för deras ovärderliga hjälp med att göra videon, särskilt B. Smith, J. Lam och S. vitt. Detta arbete stöds av Hawaiian gemenskapen Foundation (16CON-78919 och 18CON-90818) och nationella institutet för hälsa NIGMS (P20GM125508) beviljar för MY.
Materials
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
Referências
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) – Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Biologia do Desenvolvimento. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. . Virtualdub. , (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. . Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. . Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. . Object Tracker. , (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. . SwisTrack. , (2008).
