Summary

Atferdsmessige sporing og Neuromast avbildning av meksikanske Cavefish

Published: April 06, 2019
doi:

Summary

Her presenterer vi metoder for høy gjennomstrømming av en rekke meksikanske cavefish atferd og viktig farging av et mechanosensory system. Disse metodene bruker fri programvare og skreddersydd, gir en praktisk og kostnadseffektiv metode for studier av atferd.

Abstract

Hule-bolig dyr har utviklet en rekke morfologiske og atferdsmessige egenskaper til å tilpasse seg sine stadig mørke og mat-sparsom miljøer. Blant disse trekkene er foraging atferd en nyttig Vinduer i funksjonelle fordelene opptreden personlighetstrekk evolusjon. Presenteres her er oppdatert metoder for å analysere vibrasjon attraksjon atferd (VAB: en adaptiv foraging atferd) og bildebehandling av tilknyttede mechanosensors grotten-tilpasset Tetra, Astyanax mexicanus. I tillegg presenteres for høy gjennomstrømming sporing av en serie av flere cavefish inkludert hyperaktivitet og søvn-tap. Cavefish viser også sosiale, repeterende atferd og høyere angst. Derfor tjene cavefish som en dyremodell for utviklet atferd. Disse metodene bruker fri programvare og skreddersydd skript som kan brukes på andre typer atferd. Disse metodene gir praktiske og kostnadseffektive alternativer til kommersielt tilgjengelige for sporing.

Introduction

Den meksikanske tetra, Astyanax mexicanus (egentlige beinfisker: Characidae), er unik blant fisk for å ha to radikalt forskjellige alternativ morphs – en seende, overflate-bolig morph og en blind, hule-bolig morph består av flere forskjellige bestander1. Men forskjellige i morfologi og fysiologi, er de fortsatt interfertile2,3. Disse interfertile morphs synes å ha utviklet seg raskt (~ 20.000 år)4, noe som gjør dem en ideell modellsystem for studiet av rask tilpasning. Cavefish er kjent for å ha en rekke forskjellige morfologiske og atferdsmessige egenskaper inkludert økt tetthet smak knopper, økt antall mechanosensors, foraging atferd innstilt til en bestemt frekvens av en vibrerende stimulans, hyperaktivitet, og søvnløshet. Mange av disse virkemåtene trolig utviklet seg samtidig, noe som har blitt foreslått for å være fordelaktig i mørke huler foraging5 og Strømsparing i mørke og mat-sparsom6,7.

I mange evolusjonære modellsystemer er det vanskelig å skaffe integrert kunnskap om hvordan dyr morfologi og atferd endre svar for miljøet fordi de fleste arter er fordelt på en kontinuerlig forløpning i komplekse miljøer. Imidlertid har sterk kontrast mellom den hule og overflate morph Astyanax som utviklet seg i svært ulike miljøer som er preget av en skarp ecotone ført til Astyanax fremstår som en utmerket modell å forstå dyr evolusjon. Dette gjør det mulig å koble lettere gener og utviklingsprosesser adaptive trekk og utvalg i miljøet. Videre siste biomedisinsk undersøkelser av disse trekkene i Astyanax har vist at disse trekkene kan parallell menneskelige symptomer8,9,10. For eksempel er tap av sosialitet og søvn, og få hyperaktivitet, repeterende atferd og kortisol-nivået lik hva er observert hos mennesker med autisme spektrum lidelse8.

For å løse komplekse samtidig evolusjon av mange atferd og morfologiske egenskaper, er det fordelaktig å analysen mange av dem til å markere underliggende genetiske og molekylære trasé. Presenteres her er metoder for karakteriserer graden av hule-type atferdsmessige fenotyper av overflaten, hulen og hybrid morphs av Astyanax. Fokal atferd analysert betegner fenotypen er hule-tilpasset foraging atferd (vibrasjon attraksjon atferd, referert til heretter som VAB) og hyperaktivitet/hvile varigheten11,12. Også presentert er en bildebehandling metode for sensorisk systemet knyttet VAB13. Nylig mange åpen kildekode sporingsprogramvare for å kjøre atferdsmessige analyser har blitt tilgjengelig14,15. Disse fungerer godt for korte videoer, mindre enn 10 minutter. Det blir imidlertid problematisk Hvis videoen er lengre på grunn av intens beregning/sporing tid. Dugelig kommersielt tilgjengelig programvare kan være dyrt. Metodene presentert hovedsaklig freeware og derfor anses kostnadseffektivt og høy gjennomstrømming. Også inkludert er representativt resultater basert på disse metodene.

Protocol

Alle prosedyrer blir utført følge retningslinjene beskrevet i “Prinsipper for laboratoriet Animal Care” (National Institute of Health publikasjonen nummer 85-23, revidert 1985) og godkjent av University of Hawaii Manoa institusjonelle Animal Care og bruk Komiteen dyr protokollen 17-2560-3. 1. vibrasjon attraksjon atferd (VAB) analysen (≤ 10 min for hele innspillingen prosedyre) Merk: Bruk infrarødt følsom kamera eller bygge et infrarødt kamera ved å endre en U…

Representative Results

Resultatene presenteres her er representative eksempler på hva som kan oppnås med metodene presentert. Derfor kan resultatene avvike litt fra de presenteres her for både cavefish og overflate fisk avhengig av eksperimentelle forhold. Vibrasjon attraksjon atferd Representant resultater for VAB finnes i Figur 3 for både …

Discussion

Metodene presentert er lett tilgjengelig, men kan være komplisert å utføre på grunn av sin freeware opprinnelse. Derfor anbefales å utføre prøve analyser og analyser før noen faktiske eksperimentering.

Frekvensen av data generasjon kan være rask når eksperimentelle og analytiske rammen er etablert. Når etablert, er det mulig å registrere to fisk i 7 min for VAB analysen, 30 fisk i 24 for analysen aktivitet/sove og en fisk i 2,5 til 3 min for neuromast tenkelig, starter fra MS222 an…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker alle medlemmer av Yoshizawa laboratoriet inkludert N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato og I. Herren for fisk pleie på eksperimentell fisken i dette manuskriptet. Vi takker også A. Keene lab medlemmer, inkludert P. Masek å trene meg å montere IR CCD kamera. Til slutt, vi ønsker å takke Media Lab – College samfunnsfag – School of Communications på University of Hawaii-Mānoa for deres uvurderlig hjelp med å lage videoen, spesielt B. Smith, J. Lam og S. hvitt. Dette arbeidet ble støttet av Hawaii-fellesskapet stiftelse (16CON-78919 og 18CON-90818) og National Institute for Health NIGMS (P20GM125508) gir meg.

Materials

4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) MilliporeSigma D3418
880 nm wave length black light Advanced Illumination BL41192-880
avfs freeware Version 1.0.0.6 http://turtlewar.org/avfs/
Avisynth freeware Version 2.6.0 http://avisynth.nl/index.php/Main_Page
Cygwin freeware Version 2.11.0 https://www.cygwin.com/
Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) Corning 3140-100 10 cm diameter 5 cm high
Ethovision XT Noldus Information  Technology, Wageningen, The Netherlands Version 14 https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt
Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black Jardin (through Amazon.com) NA Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system
Grade A Brine shrimp eggs Brine shrimp direct BSEA16Z
ImageJ freeware Version 1.52e https://imagej.nih.gov/ij/
macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens Toyo NA Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer
Neutral Regulator Seachem NA
Optical cast plastic IR long-pass filter Edmund optics 43-948 Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam
pfmap freeware Build 178 http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom)
Reef Crystals Reef Salt Instant Ocean RC15-10
SwisTrack freeware Version 4 https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack
USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) Microsoft Q2F-00013 Cut 2-2.5 cm of the front
WinAutomation freeware Version 8 https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure)
Windows operating system Microsoft 7, 8 or 10 https://www.microsoft.com/en-us/windows
x264vfw freeware NA https://sourceforge.net/projects/x264vfw/

Referências

  1. Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
  2. Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).
  3. Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) – Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
  4. Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
  5. Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
  6. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
  7. Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
  8. Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
  9. Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
  10. Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
  11. Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
  12. Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
  13. Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Biologia do Desenvolvimento. 441 (2), 262-271 (2018).
  14. Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
  15. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  16. Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
  17. Lee, A. . Virtualdub. , (2014).
  18. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  19. Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
  20. Swimmer, B., Lang, H. H. . Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).
  21. Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. . Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).
  22. Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
  23. Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
  24. Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
  25. Rasband, W. S. . Object Tracker. , (2000).
  26. Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , (2012).
  27. Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. . SwisTrack. , (2008).
check_url/pt/59099?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Worsham, M., Fernandes, V. F. L., Settle, A., Balaan, C., Lactaoen, K., Tuttle, L. J., Iwashita, M., Yoshizawa, M. Behavioral Tracking and Neuromast Imaging of Mexican Cavefish. J. Vis. Exp. (146), e59099, doi:10.3791/59099 (2019).

View Video