Adfærdsmæssige Tracking og Neuromast billeddannelse af mexicanske Cavefish
Summary
Vi præsenterer her, metoder til høj overførselshastighed undersøgelse af en serie af den mexicanske cavefish adfærd og vitale farvning af et mechanosensory system. Disse metoder kan bruge fri software og skræddersyede scripts, giver en praktisk og omkostningseffektiv metode til undersøgelser af adfærd.
Abstract
Hulen-boligen dyr har udviklet en serie af morfologiske og adfærdsmæssige træk til at tilpasse sig deres evigt mørke og mad-sparsomme miljøer. Blandt disse træk er fouragering adfærd en af de nyttige windows i funktionelle fordele af adfærdsmæssige træk evolution. Præsenteres heri er opdateret metoder til at analysere vibrationer attraktion adfærd (VAB: en adaptive fouragering adfærd) og billeddannelse af tilknyttede mechanosensors af cave-tilpasset tetra, Astyanax mexicanus. Derudover præsenteres metoder for høj overførselshastighed tracking af en række yderligere cavefish adfærd herunder hyperaktivitet og søvn-tab. Cavefish viser også asociality, repetitive adfærd og højere angst. Derfor fungere cavefish som en dyremodel for udviklet adfærd. Disse metoder kan bruge fri software og skræddersyede scripts, der kan anvendes på andre typer af adfærd. Disse metoder giver praktiske og omkostningseffektive alternativer til kommercielt tilgængelige tracking software.
Introduction
Den mexicanske tetra, Astyanax mexicanus (Teleostei: Characidae), er unik blandt fisk for at have to radikalt forskellige alternative morphs – en seende, overflade-bolig morph og en blind, hulen-boligen morph består af flere særskilte populationer1. Selv om forskellige i morfologi og fysiologi, er de stadig interfertile2,3. Disse interfertile morfer synes at have udviklet sig hurtigt (~ 20.000 år)4, hvilket gør dem en ideel modelsystem for studiet af hurtig tilpasning. Cavefish er kendt for at have en suite af divergerende morfologiske og adfærdsmæssige træk herunder øget tæthed af smagsløg, øget antallet af mechanosensors, fouragering adfærd tunet til en bestemt frekvens af en vibrerende stimulus, hyperaktivitet, og søvnløshed. Mange af disse adfærd sandsynligvis udviklet sig samtidigt, hvoraf nogle har været foreslået for at være fordelagtige i mørke huler til fouragering5 og bevare energi i mørke og mad-sparsomme miljøer6,7.
I mange evolutionær modelsystemer er det vanskeligt at erhverve integreret viden om hvordan dyr morfologi og funktionsmåde ændring som reaktion på miljøet, fordi de fleste arter er fordelt på tværs af et kontinuerligt forløb i komplekse miljøer. Dog har kontrast mellem hule og overflade morph Astyanax der udviklede sig i stærkt kontrasterende miljøer afgrænset af en skarp ecotone ført til Astyanax fremstår som en fremragende model at forstå dyrenes udvikling. Dette gør det muligt lettere mellem gener og udviklingsprocesser med adaptive træk og udvalg i miljøet. Seneste biomedicinsk undersøgelser af disse træk i Astyanax har desuden vist, at disse egenskaber kan parallel menneskelige symptomer8,9,10. For eksempel, er tab af socialitet og søvn, og gevinst af hyperaktivitet, repetitiv adfærd og cortisol niveau lig hvad er observeret hos mennesker med autisme spektrum disorder8.
For at løse de komplekse Co-Evolution mange adfærd og morfologiske træk, er det en fordel at assay mange af dem til at fremhæve underliggende genetiske og molekylære veje. Præsenteres heri er metoder til kendetegner graden af cave-type adfærdsmæssige fænotyper af overfladen, hule og hybrid morphs af Astyanax. Fokale adfærd analyseres for at karakterisere fænotype er hule-tilpasset fouragering adfærd (vibration attraktion adfærd, benævnes fremover VAB) og hyperaktivitet/sleep varighed11,12. Også præsenteret er en billedbehandling metode til sensorisk system tilknyttet VAB13. For nylig, mange open source-tracking software til at køre adfærdsmæssige assays er blevet tilgængelig14,15. Disse arbejder meget godt for korte videoer, mindre end 10 minutter lange. Men det bliver problematisk, hvis videoen er længere på grund af intens beregning/tracking tid. I stand til kommercielt tilgængelige software kan være dyrt. De beskrevne metoder bruge primært freeware og derfor anses for omkostningseffektivt og høj overførselshastighed metoder. Også inkluderet er repræsentative resultater baseret på disse metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Disse præsenteres metoder er let adgang til men kan være kompliceret at udføre på grund af sin freeware oprindelse. Derfor er det stærkt anbefales at udføre retssag assays og analyser før nogen faktiske eksperimenter.
Data generation kan være hurtig når den eksperimenterende og analytiske ramme er etableret. Når der oprettet, er det muligt at optage to fisk i 7 min til VAB assayet, 30 fisk i 24 h for assay aktivitet/søvn og en fisk i 2,5 til 3 min. til neuromast imaging, startende f…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle medlemmerne af Yoshizawa lab herunder N. Cetraro, N. Simon, C. Valdez, C. Macapac, J. Choi, L. Lu, J. Nguyen, S. Podhorzer, H. Hernandes, J. Fong, J. Kato og I. Herren for fisk pleje på den eksperimentelle fisk, der anvendes i dette håndskrift. Vi takker også A. Keene lab medlemmer herunder s. Masek for at træne min at samle IR CCD kamera. Endelig vil vi gerne takke Media Lab – College of Social Sciences – skole for kommunikation ved University of Hawaii Mānoa for deres uvurderlige hjælp med at gøre video, især B. Smith, J. Lam og S. hvid. Dette arbejde blev støttet af Hawaiian Fællesskabet Foundation (16CON-78919 og 18CON-90818) og nationale Institut for sundhed NIGMS (P20GM125508) tilskud til min.
Materials
| 4-Di-1-ASP (4-(4-(dimethylaminostyryl)-1-methylpyridinium iodide) | MilliporeSigma | D3418 | |
| 880 nm wave length black light | Advanced Illumination | BL41192-880 | |
| avfs | freeware | Version 1.0.0.6 | http://turtlewar.org/avfs/ |
| Avisynth | freeware | Version 2.6.0 | http://avisynth.nl/index.php/Main_Page |
| Cygwin | freeware | Version 2.11.0 | https://www.cygwin.com/ |
| Cylindrical assay chamber (Pyrex 325 ml glass dish) | Corning | 3140-100 | 10 cm diameter 5 cm high |
| Ethovision XT | Noldus Information Technology, Wageningen, The Netherlands | Version 14 | https://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt |
| Fish Aquarium Cylinder Soft Sponge Stone Water Filter, Black | Jardin (through Amazon.com) | NA | Sponge filter for Sleep/hyperactivity recording system |
| Grade A Brine shrimp eggs | Brine shrimp direct | BSEA16Z | |
| ImageJ | freeware | Version 1.52e | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| macro 1.8/12.5-75mm C-mount zoom lens | Toyo | NA | Attach to USB webcam by using c-mount, which is printed in 3-D printer |
| Neutral Regulator | Seachem | NA | |
| Optical cast plastic IR long-pass filter | Edmund optics | 43-948 | Cut into a small piece to fit in the CCD of USB webcam |
| pfmap | freeware | Build 178 | http://pismotec.com/download/ (at “Download Archive” link at the bottom) |
| Reef Crystals Reef Salt | Instant Ocean | RC15-10 | |
| SwisTrack | freeware | Version 4 | https://en.wikibooks.org/wiki/SwisTrack |
| USB webcam (LifeCam Studio 1080p HD Webcam) | Microsoft | Q2F-00013 | Cut 2-2.5 cm of the front |
| WinAutomation | freeware | Version 8 | https://www.winautomation.com/ (free stand-alone app for this procedure) |
| Windows operating system | Microsoft | 7, 8 or 10 | https://www.microsoft.com/en-us/windows |
| x264vfw | freeware | NA | https://sourceforge.net/projects/x264vfw/ |
Referências
- Keene, A. C., Yoshizawa, M., McGaugh, S. E. . Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. Biology and Evolution of the Mexican Cavefish. , (2015).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R. . Mexican eyeless characin fishes, genus Astyanax: Environment, distribution, and evolution.Special publications the museum Texas Tech University. (12), (1977).
- Wilkens, H. Evolution and genetics of epigean and cave Astyanax-fasciatus (Characidae, Pisces) – Support for the neutral mutation theory. Evolutionary Biology. 23, 271-367 (1988).
- Fumey, J., Hinaux, H., Noirot, C., Thermes, C., Rétaux, S., Casane, D. Evidence for late Pleistocene origin of Astyanax mexicanus cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 1-19 (2018).
- Yoshizawa, M., Gorički, S., Soares, D., Jeffery, W. R. Evolution of a behavioral shift mediated by superficial neuromasts helps cavefish find food in darkness. Current Biology. 20 (18), 1631-1636 (2010).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877 (2014).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. The energetic cost of vision and the evolution of eyeless Mexican cavefish. Science Advances. 1 (8), e1500363 (2015).
- Yoshizawa, M., et al. The Evolution of a Series of Behavioral Traits is associated with Autism-Risk Genes in Cavefish. BMC Evolutionary Biology. 18 (1), 89 (2018).
- Riddle, M. R., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Protas, M. E., et al. Genetic analysis of cavefish reveals molecular convergence in the evolution of albinism. Nature Genetics. 38 (1), 107-111 (2006).
- Yoshizawa, M., et al. Distinct genetic architecture underlies the emergence of sleep loss and prey-seeking behavior in the Mexican cavefish. BMC Biology. 13 (1), 15 (2015).
- Duboué, E. R., Keene, A. C., Borowsky, R. L. Evolutionary convergence on sleep loss in cavefish populations. Current Biology. 21 (8), 671-676 (2011).
- Fernandes, V. F. L., Macaspac, C., Lu, L., Yoshizawa, M. Evolution of the developmental plasticity and a coupling between left mechanosensory neuromasts and an adaptive foraging behavior. Biologia do Desenvolvimento. 441 (2), 262-271 (2018).
- Pérez-Escudero, A., Vicente-Page, J., Hinz, R. C., Arganda, S., de Polavieja, G. G. idTracker: tracking individuals in a group by automatic identification of unmarked animals. Nature Methods. 11, 743 (2014).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Yoshizawa, M., Jeffery, W. R., Van Netten, S. M., McHenry, M. J. The sensitivity of lateral line receptors and their role in the behavior of Mexican blind cavefish (Astyanax mexicanus). Journal of Experimental Biology. 217 (6), (2014).
- Lee, A. . Virtualdub. , (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Cavallari, N., et al. A blind circadian clock in cavefish reveals that opsins mediate peripheral clock photoreception. PLoS Biology. 9 (9), e1001142 (2011).
- Swimmer, B., Lang, H. H. . Surface Wave Discrimination between Prey and Nonprey by the Back Swimmer Notonecta glauca L. (Hemiptera , Heteroptera ). 6 (3), 233-246 (1980).
- Montgomery, J. C., Macdonald, J. A. . Sensory Tuning of Lateral Line Receptors in Antarctic Fish to the Movements of Planktonic Prey. 235 (4785), 195-196 (1987).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A., Sung, R. J., Schier, A. F. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. The Journal of Neuroscience. 26 (51), 13400-13410 (2006).
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P. Melatonin promotes sleep-like state in zebrafish. Brain Research. 903 (1-2), 263-268 (2001).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (95), e52321 (2015).
- Rasband, W. S. . Object Tracker. , (2000).
- Ferreira, T., Rasband, W. Create Shortcuts. ImageJ User Guide. , (2012).
- Lochmatter, T., Roduit, P., Cianci, C., Correll, N., Jacot, J., Martinoli, A. . SwisTrack. , (2008).
