Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması
Summary
Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.
Abstract
Proteinlerin küçük protein ubiquitin tarafından posttranslational modifikasyonu birçok hücresel olaylarda yer almaktadır. Her yerde bulunan proteinlerin triptik sindiriminden sonra, lisin epsilon amino grubuna konjuge bir diglycine kalıntısı olan peptidler (‘K-ε-diglycine’ veya sadece ‘diGly’) orijinal modifikasyon bölgesini izlemek için kullanılabilir. Kitle spektrometresi ile hassas algılama ile birlikte diGly peptidlerin etkin immünpurifikasyonu, bugüne kadar tanımlanan ubikitinasyon bölgelerinin sayısında büyük bir artışa yol açmıştır. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Ayrıca, antikor boncukları korumak için filtre tabanlı bir fiş kullanarak numunenin daha verimli temizlenmesi, diGly peptidler için daha fazla özgüllük sağlar. Bu gelişmeler, hücrede proteozom inhibisyonu üzerine insan servikal kanser hücrelerinden 23.000’den fazla diGly peptidin rutin tespiti ile sonuçlanır (HeLa) hücre lisatları. Bu stratejinin etkinliğini, birkaç farklı hücre tipinin ve beyin dokusu gibi in vivo örneklerinin ubiquitinome profillerinin derinlemesine analizi için gösteriyoruz. Bu çalışma derin hücresel ubiquitinome ortaya çıkarmak için protein ubiquitination analizi için araç kutusuna orijinal bir ek sunuyor.
Introduction
Proteinlere ubiquitin konjugasyonu proteozom tarafından bozulması için onları işaretler ve proteostaz önemli bir süreçtir. Ubikitin C-terminal karboksil grubu hedef protein1,,2lizin ε-amino grubu ile bir izopeptid bağ oluşturur. Buna ek olarak, ubikitin diğer ubikitin modülleri eklenebilir, homojen oluşumu ile sonuçlanan (yani, K48 veya K11) veya dallı (yani, heterojen veya karışık) poliubiquitin yapılar1,3. Ubiquitin en iyi bilinen fonksiyonu proteazomal bozulma rolüdür, K48 bağlı poliubiquitin aracılık. Ancak, hem mono-hem de poliubiquitination da proteozom tarafından bozulmabağımsız birçok süreçte rol oynadığı açık hale gelmiştir. Örneğin, K63 bağlı zincirleri hücre içi ticareti, lizomal bozulma, kinaz sinyalizasyonu ve DNA hasar yanıtı4,,5nondegradative rolleri var. Diğer altı bağlantı türleri daha az bol ve rolleri hala büyük ölçüde esrarengiz, hücredeki işlevleri hakkında ilk göstergeler ortaya çıkıyor olsa da, büyük ölçüde bağlantı-özel algılama sağlamak için yeni araçların geliştirilmesi nedeniyle6,7.
Kütle spektrometresi proteom analizleri için vazgeçilmez bir araç haline gelmiştir ve günümüzde hemen hemen her biyolojik kaynaktan binlerce farklı protein tek bir deneyde tespit edilebilir. Protein aktivitesini modüle edebilen proteinlerin (örn. fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon ve her yerde) posttranslational modifikasyonları (PtM’ler) ile ek bir karmaşıklık tabakası sunulur. PTM taşıyan proteinlerin büyük ölçekli tanımlanması da kütle spektrometresi alanındaki gelişmelerle mümkün olmuştur. PBM’leri taşıyan peptidlerin, değiştirilmemiş muadillerine göre nispeten düşük stoiyometrisi teknik bir zorluk teşkil eder ve kütle spektrometresi analizi öncesinde biyokimyasal zenginleştirme adımları genellikle gereklidir. Son yirmi yılda, PTM’lerin analizi için birkaç farklı özel zenginleştirme yöntemi geliştirilmiştir.
Hücrede protein ubiquitination çok yönlü rolleri nedeniyle, proteinler üzerinde ubikitinasyon sitelerinin tespiti için analitik yöntemlerin geliştirilmesi için büyük bir talep var8. Kütle spektrometrik yöntemlerin uygulanması meyve sinek, fare, insan ve maya proteinleri9,10,,11,12,13,14tanımlanan ubiquitination sitelerin in sayısının bir patlamaya yol açmıştır . K-ε-GG kalıntısı motifine (ayrıca ‘diglycine’ veya ‘diGly’ olarak da adlandırılır) karşı yönlendirilmiş antikorlar kullanılarak peptid düzeyinde immünopreprezet bazlı zenginleştirme stratejilerinin geliştirilmesi ile önemli bir adım sunulmuştur. Bu diGly peptidler proteazolaraktripsin kullanarak her yerde proteinlerin sindirim üzerine üretilir15 ,16.
Burada, orbitrap kütle spektrometresi tarafından immünpurifikasyon ve sonraki tespiti kullanarak diGly peptidler için zenginleştirmek için optimize edilmiş bir iş akışı saiyoruz. Özellikle numune hazırlama ve kütle spektrometresi aşamalarında mevcut iş akışlarının çeşitli değişikliklerinin bir kombinasyonunu kullanarak, proteozom ile tedavi edilen Tek Bir HeLa hücresi örneğinden rutin olarak 23.000’den fazla diGly peptid tespit edebiliriz. inhibitörü ve tedavi edilmeyen HeLa hücrelerinden ~ 10.000. Bu protokolü, hücre kültüründe (SILAC) etiketli amino asitlerle etiketsiz ve kararlı izotop etiketlemeden gelen lysatlara ve beyin dokusu gibi endojen örneklere uyguladık.
Bu iş akışı, derin ubiquitinome ortaya çıkarmak için her yerde analiz için araçların repertuar değerli bir ek sunuyor. Aşağıdaki protokol, iş akışının tüm adımlarını ayrıntılı olarak açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, kültür hücreleri ve in vivo doku gibi çeşitli biyolojik kaynaklardan alınan örneklere uygulanmıştır. Her durumda, toplam protein giriş miktarının en az 1 mg olması koşuluyla binlerce diGly peptid tespit ettik. Spesifik antikorlar kullanılarak zenginleştirme, ubikitinated proteinler veya diGly peptidler için hiçbir zenginleştirme prosedürleri uygulanmış ise sadece en fazla 100-150 çok düşük bol diGly peptidler tüm hücre lysates tespit edildiği göz önüne alınd?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Hollanda Bilimsel Araştırma Örgütü (NWO) tarafından Ulusal Yol Haritası Büyük Ölçekli Araştırma Tesisleri (proje numarası 184.032.201) kapsamında finanse edilen Hollanda Proteomik Merkezi’nin bir programı olan “Proteins at Work” projesinin bir parçasıdır. ).
Materials
| 1,4-Dithioerythritol | Sigma-Aldrich | D8255 | |
| 3M Empore C18 Octadecyl disks | Supelco | 66883-U | product discontinued at Supelco; CDS Analytical is the new manufacturer (https://www.cdsanalytical.com/empore) |
| Ammonium formate | Sigma-Aldrich | 70221 | |
| Bortezomib | UBPbio | ||
| CSH130 resin, 3.5 μm, 130 Å | Waters | ||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | 34869 | |
| DMEM | ThermoFisher | ||
| EASY-nanoLC 1200 | ThermoFisher | ||
| FBS | Gibco | ||
| GF/F filter plug | Whatman | 1825-021 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I6125 | |
| Lysine, Arginine | Sigma-Aldrich | ||
| Lysine-8 (13C6;15N2), Arginine-10 (13C6;15N4) | Cambridge Isotope Laboratories | ||
| Lysyl Endopeptidase(LysC) | Wako Pure Chemicals | 129-02541 | |
| NanoLC oven | MPI design, MS Wil GmbH | ||
| N-Lauroylsarcosine sodium salt | Sigma-Aldrich | L-5125 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | ThermoFisher | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher / Pierce | 23225 | |
| PLRP-S (300 Å, 50 µm) polymeric reversed phase particles | Agilent Technologies | PL1412-2K01 | |
| PTMScan Ubiquitin Remnant Motif (K-ε-GG) Kit | Cell Signaling Technologies | 5562 | |
| Sep-Pak tC18 6 cc Vac Cartridge | Waters | WAT036790 | Remove the tC18 material from the cartridge before filling the cartridge with PLRP-S |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | |
| Tris-base | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Trypsin, TPCK Treated | ThermoFisher | 20233 |
Referências
- Clague, M. J., Urbé, S. Ubiquitin: Same molecule, different degradation pathways. Cell. 143, 682-685 (2010).
- Ciechanover, A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway. Cell. 79 (1), 13-21 (1995).
- Ohtake, F., Tsuchiya, H. JB special review – Recent topics in ubiquitin-proteasome system and autophagy: The emerging complexity of ubiquitin architecture. Journal of Biochemistry. 161 (2), 125-133 (2017).
- Bergink, S., Jentsch, S. Principles of ubiquitin and SUMO modifications in DNA repair. Nature. 458 (7237), 461-467 (2009).
- Komander, D., Rape, M. The Ubiquitin Code. Annual Review of Biochemistry. 81 (1), 203-229 (2012).
- Michel, M. A., Swatek, K. N., Hospenthal, M. K., Komander, D. Ubiquitin Linkage-Specific Affimers Reveal Insights into K6-Linked Ubiquitin Signaling. Molecular Cell. 68 (1), 233-246 (2017).
- Swatek, K. N., et al. Insights into ubiquitin chain architecture using Ub-clipping. Nature. 572, 533-537 (2019).
- Peng, J., et al. A proteomics approach to understanding protein ubiquitination. Nature Biotechnology. 21 (8), 921-926 (2003).
- Wagner, S. A., et al. Proteomic Analyses Reveal Divergent Ubiquitylation Site Patterns in Murine Tissues. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1578-1585 (2012).
- Iesmantavicius, V., Weinert, B. T., Choudhary, C. Convergence of Ubiquitylation and Phosphorylation Signaling in Rapamycin-treated Yeast Cells. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 1979-1992 (2014).
- Elia, A. E. H., et al. Quantitative Proteomic Atlas of Ubiquitination and Acetylation in the DNA Damage Response. Molecular Cell. 59 (5), 867-881 (2015).
- Wagner, S. A., et al. A Proteome-wide, Quantitative Survey of In Vivo Ubiquitylation Sites Reveals Widespread Regulatory Roles. Molecular & Cellular Proteomics. 10 (10), M111.013284 (2011).
- Udeshi, N. D., et al. Methods for Quantification of in vivo Changes in Protein Ubiquitination following Proteasome and Deubiquitinase Inhibition. Molecular & Cellular Proteomics. 11, 148-159 (2012).
- Sap, K. A., Bezstarosti, K., Dekkers, D. H., Voets, O., Demmers, J. A. Quantitative proteomics reveals extensive remodeling of the ubiquitinome after perturbation of the proteasome by dsRNA mediated subunit knockdown. Journal of Proteome Research. 16 (8), 2848-2862 (2017).
- Xu, G., Paige, J. S., Jaffrey, S. R. Global analysis of lysine ubiquitination by ubiquitin remnant immunoaffinity profiling. Nature Biotechnology. 28 (8), 868-873 (2010).
- Kim, W., et al. Systematic and quantitative assessment of the ubiquitin-modified proteome. Molecular Cell. 44 (2), 325-340 (2011).
- Wakabayashi, M., et al. Phosphoproteome analysis of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue sections mounted on microscope slides. Journal of Proteome Research. 13 (2), 915-924 (2014).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11 (12), 2301-2319 (2016).
- Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (June), 731-740 (2016).
- Rose, C. M., et al. Highly Multiplexed Quantitative Mass Spectrometry Analysis of Ubiquitylomes. Cell Systems. 3 (4), 395-403 (2016).
- Kaiser, S. E., et al. Protein standard absolute quantification (PSAQ) method for the measurement of cellular ubiquitin pools. Nature Methods. 8 (8), 691-696 (2011).
- Van Der Wal, L., et al. Improvement of ubiquitylation site detection by Orbitrap mass spectrometry. Journal of Proteomics. (July), (2017).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
