泛蛋白与蛋白质的结合标志着蛋白酶体降解，是蛋白酶病的关键过程。泛素的C端卡博基组与目标蛋白^11、22的裂氨酸-氨基组形成等肽键。此外，泛素可以附着在其他泛素模块上，导致形成均匀（即K48或K11）或分支（即异质或混合）聚氨基金结构^11、3。3泛蛋白的最广为人知的功能是它在蛋白酶体降解中的作用，由K48链接的多聚丙酮介导。然而，很明显，单一和多聚二化在许多独立于蛋白酶体降解的过程中也扮演着角色。例如，K63相关链在细胞内贩运、肌营养不良退化、激酶信号和DNA损伤反应^44、55等具有非降解作用。其他六种链接类型较少，它们的作用仍然在很大程度上是神秘的，尽管关于它们在细胞中功能的最初迹象正在出现，这主要是因为开发了新工具，使链接特定的检测^66，7。7

质谱法已成为蛋白质组分析不可或缺的工具，如今，几乎任何生物来源的数千种不同的蛋白质都可以在单个实验中被识别。蛋白质（例如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）的翻译后修饰（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛化）又提出了一层复杂性，这些蛋白质可以调节蛋白质活性。大规模识别PTM轴承蛋白也通过质谱学领域的发展成为可能。与未修改的肽相比，携带PTM的肽的渗透量相对较低，这带来了技术挑战，在质谱分析之前，一般需要生化浓缩步骤。在过去二十年中，为分析PTM开发了几种不同的具体浓缩方法。

由于蛋白质泛化在细胞中的多方面作用，因此对开发分析方法以检测蛋白质⁸的泛化位点有很大的需求。质谱方法的应用，导致果蝇、小鼠、^,人类和酵母蛋白^{9、10、11、12、13、1410,11}中已识别的⁹泛化位点数量激增。^12,13,14在肽水平上开发基于免疫沉淀的浓缩策略，利用针对K-+-GG残余图案的抗体（也称为”diglycine”或”diGly”）提出了一个重大步骤。这些二甘肽是在消化泛化蛋白时产生的，使用胰蛋白酶作为蛋白酶^{15，16。15,}

在这里，我们提出了一个优化的工作流程，以丰富使用免疫纯化和Orbitrap质谱检测的二Gly肽。结合现有工作流程的多项修改，特别是在样品制备和质谱阶段，我们现在可以从用蛋白酶体处理的HeLa细胞单个样本中常规识别超过 23，000 个二Gly 肽未经治疗的HeLa细胞的抑制剂和±10，000。我们应用了该协议，从未标记和稳定的同位素标签与氨基酸在细胞培养（SILAC）标记HeLa细胞，以及内源性样本，如脑组织。

此工作流为分析无所不在位点以揭示深层泛化值的工具系列提供了宝贵的补充。以下协议详细介绍了工作流的所有步骤。