Neuronal excitability kan være modulert gjennom en dynamisk prosess endo- og exocytosis av eksitatoriske ionotropic glutamat reseptorer. Beskrevet her er tilgjengelig, høyt innhold analysen for kvantifisering overflate og interne reseptor befolkningen bassenger.
Postsynaptic smugling av reseptorer til og fra celleoverflaten er en viktig mekanisme som neurons modulerer deres respons på ulike stimuli. De α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA)-reseptorene, som er ansvarlig for rask eksitatoriske synaptic overføring i nerveceller, smugles til og fra postsynaptic overflaten til å dynamisk endre neuronal excitability. AMPA reseptor handel er avgjørende for synaptiske plastisitet og kan bli forstyrret i nevrologisk sykdom. Imidlertid utbredt metoder for kvantifisering reseptor menneskehandel ignorere hele reseptor bassenger, er altfor tid – og arbeidskrevende, eller potensielt forstyrre normal menneskehandel mekanismer og derfor komplisere tolkningen av resultatdataene. Vi presenterer en høyt innhold analysen for kvantifisering av både overflate og interne AMPA reseptor bestander i kulturperler primære hippocampus neurons bruker dobbel fluorescerende immunolabeling og en nær-infrarøde fluorescerende 96-brønnen microplate skanner. Denne tilnærmingen muliggjør rask screening av bulk internalisert og overflaten reseptor tettheter samtidig minimere utvalget materialet. Vår metode har imidlertid begrensninger i å skaffe encellede oppløsning eller gjennomføre levende celle bildebehandling. Til slutt kan denne protokollen være mottakelig for andre reseptorer og ulike celletyper, forutsatt riktig justeringer og optimalisering.
Størrelsen og tidsmessige dynamikken i neuronal excitability er i stor grad avhengig av tilgjengelighet og sammensetningen av overflaten reseptor populasjoner som transduce elektrokjemiske signal. Mens syntese av ny reseptorer (eller reseptor underenheter) er vanligvis en relativt langvarige og energisk dyrt prosess, en rekke cellulære maskiner dedikert til endo- og exocytosis av eksisterende reseptorer sørge for sine raskt innsetting og flytting til og fra membranen1. Derfor, i tillegg til transcriptional og translasjonsforskning regulering av reseptorer, posttranslational reseptor menneskehandel er en viktig modulator av neuronal excitability.
Synaptiske plastisitet, eller endre styrken av forbindelser mellom neurons med erfaring, antas å danne grunnlaget for læring og hukommelse2,3. Styrke og svekkelse av synapser over tid, kalles langsiktige potensiering (LTP) og langsiktig depresjon (LTD), henholdsvis kan være modulert via smugling av α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) reseptorer 4 , 5. AMPA reseptorer er heterotetramers består av fire underenheter (GluA1-4), og formidle fleste fort eksitatoriske synaptic overføring i hjernen6. Dermed er Nevron excitability i stor grad en funksjon av antallet AMPA reseptorer på postsynaptic overflaten tilgjengelig aktiveres av glutamat. LTD er vanligvis forbundet med en økning i AMPA reseptor endocytose, mens LTP er hovedsakelig knyttet til en økning i AMPA reseptor exocytosis. Postsynaptic overflate uttrykk for AMPA reseptorer krever endosomal levering til exocytotic proteiner, der sammensmelting med plasma membranen deretter oppstår i en kalsium-avhengig måte7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. det finnes også en rekke mekanismer som regulerer aktiviteten avhengig AMPA reseptor endocytose. Et eksempel på dette er via umiddelbar tidlig genet Arc/Arg3.1 (Arc). Blant andre funksjoner15, Arc er kjent for å megle metabotropic glutamat reseptor (mGluR)-avhengige LTD ved å fremme AMPA reseptor endocytose gjennom sin binding partnere, som inkluderer endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 og dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, på clathrin-belagt groper20,21. Internalisert AMPA reseptorer kan enten resirkulert tilbake til plasma membranen eller øremerket fornedrelse22,23.
Viktigere, bidrar delenhet sammensetningen av AMPA reseptorer til deres menneskehandel dynamics24. Av stor relevans er intracellulær C-terminalen domenet til underenheter, hvor fleste posttranslational modifikasjoner og handel-relaterte protein interaksjoner skje. GluA1 og GluA4 delenhet inneholder AMPA reseptorer er spesielt passende til som smugles til celleoverflaten under LTP, delvis på grunn av deres PDZ ligander, ~ 90 amino acid sekvenser som fremmer membran forankring via interaksjon med ulike PDZ domenet inneholder proteiner25,26. På den annen side, pleier AMPA reseptorer som inneholder GluA2 og mangler GluA1 eller GluA4 å være trafikkerte constitutively men samle intracellulært med synaptic aktivitet27. GluA2 underenheter gjennomgå RNA redigering, i tillegg til fremme oppbevaring i det endoplasmatiske retikulum28, gjengir kanal pore ugjennomtrengelig kalsium29, ytterligere implicating delenhet-spesifikke smugling som en viktig formidler av neuronal homeostasis og plastisitet. Interessant, har avbrudd i ubiquitin-avhengige Arc fornedrelse vist seg å øke GluA1 endocytose og øke overflaten uttrykk for GluA2 delenhet inneholder AMPA reseptorer etter induksjon av mGluR-LTD med selektiv gruppe I mGluR Agonistiske (S) – 3,5 – Dihydroxyphenylglycine (DHPG), som angir at mye er fortsatt for å lære om mekanismer og rollen som delenhet-spesifikke AMPA reseptor menneskehandel30.
Metoder for å observere endringer i overflaten uttrykk av reseptorer er ofte tungvint, tidkrevende, eller introdusere unødvendige forundrer. Biotin-baserte analyser er en gjennomgripende og kommersielt tilgjengelig tilnærming. Affinitet rensing biotinylated overflate reseptorer representerer et slikt eksempel, men nødvendigheten av å utføre geleelektroforese krever en stor mengde utvalget materialet og kan gjengi screening av flere behandlinger en uoverkommelig lengre behandle31. Utvidelser av denne analysen, der flere tidspunkt med merking og immunoprecipitations utføres for å kvantifisere gradvis nedbrytning av et innledende signal, tilsvarende forsømmelse tillegg av ny- eller resirkulert-reseptorer til cellen overflaten og bare forverre tid og materielle krav.
Andre tilnærminger gjør bruk av chimeric konstruksjoner eller tillegg av fluorescerende koder å observere reseptor menneskehandel32, noen ganger bruke live celle tenkelig33,34. Mens potensielt mektig, kan designene påvirke normale menneskehandel mønstre av reseptorer på grunn av mutasjoner eller dramatiske endringer i molekylvekt introdusert i disse proteinene. Bruk av fargestoffer at etiketten subcellular avdelinger av målretting lav pH34,35 er uspesifikke og skille mellom forskjellige intracellulær rom viktig for reseptor menneskehandel (f.eks. lysosomer og proteasomes) vanskelig. Til slutt, bruk av AC confocal mikroskopi å visualisere colocalization av reseptorer med markører knyttet til handel og fornedrelse, for eksempel endosomal proteiner eller clathrin, mens å gi nyttig innsikt i bestemte lokalisering med subcellular oppløsning, er tid, arbeidskrevende og dyrt på grunn av nødvendigheten av individuelt analysere hver celle og kravet til AC confocal eller super-oppløsning mikroskopi.
Her viser vi en høyt innhold reseptor menneskehandel analysen som er kompatibel med primære neuronal kultur forberedelser30. Denne metoden merker separat overflate og intracellulær reseptor bassengene fast neurons, slik at presentasjonen av data som et forhold mellom normalisert overflaten eller internalisert reseptor tetthet til den samlede tettheten for at reseptor. Høyt innhold natur denne metoden er ideell for screening flere behandlinger og/eller genotyper i et kort tidsrom, og krever kun celle dyrking og antistoff inkubasjon kompetanse.
Kort, primære neurons er dyrket i standard 96-brønnen microplates og deretter behandlet som diktert av eksperimentell design, inkubert med primære antistoffer, vasket og fast. Celler er deretter inkubert med en sekundær antistoff merke overflate reseptorer, etterfulgt av en annen fiksering trinn. Permeabilization deretter oppstår og en andre sekundære antistoff brukes til å navngi interne reseptor bassenger. Endelig er celler fotografert ved hjelp av en infrarød fluorescerende microplate skanner for å kvantifisere integrert tettheten av hver reseptor befolkningen. Figur 1 oppsummerer analysen vår høyt innhold i forhold til en tradisjonell biotinylation analysen.
Mens protokollen tilbys her er optimalisert og spesifikke for AMPA reseptor menneskehandel primære hippocampus Nevron kulturer, bli denne prosedyren kan, i teorien, utvidet og tilpasset ulike reseptorer i forskjellige celletyper.
AMPA reseptorer er en ionotropic glutamat reseptor undertype som er integrert for neuronal funksjoner inkluderer synapse formasjon, synapse stabilitet og synaptiske plastisitet. AMPA reseptor avbrudd er koblet til flere nevrologiske lidelser24 og betraktes attraktive narkotika mål40. For eksempel har studier vist at en av de tidligste tegnene på Alzheimers sykdom (AD) synapse tap og redusert synaptic AMPA reseptor nivåer41,42. Intriguingly, svekker tillegg av Amyloid-ß oligomers overflate GluA1 inneholder AMPA reseptor uttrykk synapser43. Videre regulerer status epilepticus ned-GluA2 mRNA og protein i hippocampus neurons før deres død44. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi, en ALS-spesifikke molekylær abnormitet, har vært knyttet til ineffektiv GluA2 Q/R området-RNA redigering45.
Høyt innhold AMPA reseptor menneskehandel analysen gir et effektivt middel for å måle masseendringer i reseptor menneskehandel profiler innenfor et nevrale nettverk svar på ulike faktorer, forbruker mye mindre tid og materialer enn alternative metoder. En enkelt 96-brønnen microplate gir mange brønner for å kjøre flere tekniske replikerer og kontrollerer for ulike eksperimentelle forhold i samme plate. Lav plating tetthet 2 x 104 celler/godt i forhold til 5 x 105 celler/vel tetthet reduserer antall dyr og materialer kreves for hvert eksperiment (figur 1). Infrarød skanneren kan bildet opptil seks 96-brønnen microplates samtidig. Analysen kan også endres til en 384-vel microplate46, som blir spesielt verdifull hvis analysen kjøres på dyrebare prøver som er vanskelig å få eller er dyrt å kultur (f.eks menneskelige prøver og indusert pluripotent stamceller). Hele analysen kan fullført og analyseres på samme dag, som sparer verdifull tid (figur 1).
For vellykket og effektiv gjennomføring av analysen må noen punkter vurderes. Først er det viktig å forberede DHPG løsningen på samme dag av Nevron. Ikke gjenbruk eller fryse DHPG aksjer. 4% paraformaldehyde/4% sukrose i PBS løsning bør også gjøres frisk på samme dag av eksperimentet. Andre kontroll brønner behandlet med TTX bare eller kjøretøy er nødvendig å sikre at effektene observert er spesifikke for behandling. Det er også viktig med brønner behandlet med bare de sekundære Antistoffene mot kontroll for bakgrunnen fluorescens produsert av ikke-spesifikk bindende. Merk at andre fiksering trinn (følgende bleke av sekundær antistoffer) er nøkkelen til å redusere sekundære antistoff bakgrunn effekter og oppnå effektiv merking av reseptor underenheter.
Kompromisser og begrensninger, eksisterer som med enhver metode. Denne analysen gir ikke encellede (eller subcellular) og tillater ikke sanntidssporing reseptoren menneskehandel som andre metoder32,33,35. I tillegg må riktig omsorg tas under permeabilization trinnet av neurons, som denne metoden vil være følsomme for lekkasje av intracellular komponentene i over permeabilization.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Zachary Allen for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av Whitehall Foundation (Grant 2017-05-35) og Cleon C. Arrington forskning innvielsen Grant Program (RIGG-93) å A.M.M. M.A.G. og D.W.Y. ble begge støttet av en Georgia State University Neurogenomics 2CI fellesskap.
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |