Neuronal ophidselse kan moduleres gennem en dynamisk proces af endo- og exocytose excitatoriske ionotropic glutamat receptorer. Beskrevet her er en tilgængelig, high-indhold analyse til kvantificering overflade og indre receptor deltagergrupper.
Postsynaptiske handel med receptorer til og fra cellens overflade er en vigtig mekanisme som neuroner modulere deres reaktionsevne på forskellige stimuli. Α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptorer, som er ansvarlig for hurtigt excitatoriske synaptisk transmission i neuroner, der handles til og fra den postsynaptiske overflade til at ændre dynamisk neuronal ophidselse. AMPA receptor handel er essentiel for synaptisk plasticitet og kan afbrydes i neurologisk sygdom. Dog udbredt tilgange til kvantificering af receptor handel ignorere hele receptor puljer, er alt for tid – og arbejdskrævende, eller potentielt forstyrre normale handel mekanismer og således komplicere fortolkningen af resulterende data. Vi præsenterer en høj-indhold analyse til kvantificering af både overflade og indre AMPA-receptoren populationer i kulturperler primære hippocampus neuroner ved hjælp af dobbelt fluorescerende immunolabeling og en nær-infrarødt fluorescerende 96-brønd mikrotiterplade scanner. Denne tilgang fremmer hurtig screening af bulk internaliseret og overflade receptor tætheder samtidig minimere prøvemateriale. Vores metode har imidlertid begrænsninger i at opnå én celle opløsning eller gennemføre levende celle billeddannelse. Endelig, denne protokol kan være modtagelig til andre receptorer og forskellige celletyper, forudsat at passende justeringer og optimering.
Omfang og tidsmæssige dynamics af neuronal ophidselse er stort set afhængig af tilgængelighed og sammensætningen af overflade receptor populationer, som transduce elektrokemiske signaler. Syntese af nye receptorer (eller receptor underenheder) er generelt en energisk dyre og forholdsvis langvarige proces, et væld af cellulære maskiner dedikeret til endo- og exocytose af eksisterende receptorer giver mulighed for deres hurtig indsættelse og fjernelse til og fra membran1. Derfor, ud over det transkriptionel og translationel regulering af receptorer, posttranslationelle receptor handel er et vigtigt modulator af neuronal ophidselse.
Synaptisk plasticitet, eller den ændrede styrke forbindelser mellem neuroner med erfaring, menes at danne grundlag for læring og hukommelse2,3. Styrkelse og svækkelse af synapser over tid, betegnes langsigtede potensering (LTP) og langvarig depression (LTD), henholdsvis, kan moduleres gennem handel med α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syre (AMPA) receptorer 4 , 5. AMPA-receptorer er heterotetramers bestående af fire underenheder (GluA1-4), og mægle størstedelen af hurtigt excitatoriske synaptisk transmission i hjernen6. Neuron ophidselse er således i vid udstrækning en funktion af mængden af AMPA-receptorer på den postsynaptiske overflade kan aktiveres af glutamat. LTD er ofte forbundet med en forhøjelse af AMPA-receptoren endocytose, hvorimod LTP er overvejende knyttet til en forøgelse af AMPA-receptoren exocytose. Postsynaptiske overflade udtryk af AMPA-receptorer kræver endosomal levering til exocytotic proteiner, hvor fusion med plasmamembran derefter forekommer i en calcium-afhængige måde7,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. der findes også et væld af mekanismer, der regulerer aktivitet afhængig af AMPA-receptoren endocytose. Et eksempel herpå er via den umiddelbare tidlig gen Arc/Arg3.1 (Arc). Blandt andre funktioner15, Arc er kendt at mægle metabotropic glutamat receptor (mGluR)-afhængige LTD ved at fremme AMPA-receptoren endocytose gennem dets bindende partnere, som omfatter endocytic proteiner AP-2, endophilin-3 og dynamin-2 16 , 17 , 18 , 19, på clathrin-belagt Gruber20,21. Internaliseret AMPA-receptorer kan enten genbruges tilbage til plasma membran eller øremærket til nedbrydning22,23.
Vigtigere, bidrager subunit sammensætningen af AMPA-receptorer til deres menneskehandel dynamics24. Af stor betydning er de intracellulære C-terminal domæne underenheder, hvor fleste af posttranslationelle modifikationer og handel-relaterede protein interaktioner forekomme. GluA1 og GluA4 subunit-holdige AMPA-receptorer er særligt egnet til at være smugles til cellens overflade under LTP, delvis på grund af tilstedeværelsen af deres PDZ ligander, ~ 90 aminosyre-sekvenser, der fremmer membran forankring via interaktion med forskellige PDZ domæne-holdige proteiner25,26. På den anden side AMPA-receptorer indeholdende GluA2 og mangler GluA1 eller GluA4 har tendens til at være smugles constitutively men ophobes intracellulært med synaptic aktivitet27. GluA2 subunits gennemgå RNA redigering, som, ud over at fremme fastholdelse i det endoplasmatiske reticulum28, gengiver kanal pore uigennemtrængelige for calcium29, yderligere implicere subunit-specifikke menneskehandel som en vigtig mediator af neuronal homøostase og plasticitet. Interessant, har afbrydelse af ubiquitin-afhængige Arc nedbrydning vist sig at øge GluA1 endocytose og øge den overflade udtryk af GluA2 subunit-holdige AMPA-receptorer efter induktion af mGluR-LTD med den selektive gruppe I mGluR agonist (S) – 3,5 – Dihydroxyphenylglycine (DHPG), der angiver, at stadig meget læres med hensyn til mekanismer og rolle subunit-specifikke AMPA-receptoren menneskehandel30.
Metoder til at observere ændringer i overflade udtryk af receptorer er ofte besværligt, tidskrævende, eller indføre unødvendige tilintetgør. Biotin-baserede assays er en pervasive og kommercielt tilgængelige tilgang. Affinitet rensning af biotinylated overflade receptorer repræsenterer et eksempel, men nødvendigheden af at udføre elektroforese kræver en stor mængde af prøvemateriale og kan gengive screening af flere behandlinger et uoverkommeligt lang processen31. Udvidelser af denne analyse, hvor flere tidspunkter af mærkning og immunoprecipitations udføres for at kvantificere den gradvise nedbrydning af et indledende signal, ligeledes forsømme tilføjelsen af nye — eller genanvendt-receptorer på cellen overflade og kun forværre tid og materielle krav.
Andre tilgange gøre brug af kimære konstruktioner eller tilsætning af fluorescerende tags at observere receptor menneskehandel32, sommetider ved hjælp af live cell imaging33,34. Mens potentielt magtfulde, kan disse designs påvirke de normale handel med mønstre af receptorer på grund af mutationer eller dramatiske ændringer i Molekylær vægt indført i disse proteiner. Brugen af farvestoffer at etiketten subcellulært rum ved at målrette lave pH34,35 er uspecifikke og skelne mellem forskellige intracellulære rum vigtig for receptor menneskehandel (e.g. lysosomer og proteasomes) vanskeligt. Endelig brugen af Konfokal mikroskopi til at visualisere colocalization receptorer med datamærker forbundet med handel og nedbrydning, såsom endosomal proteiner eller clathrin, samtidig potentielt nyttig indsigt i specifikke lokalisering med subcellulært opløsning, er tid, arbejdskrævende og dyrt på grund af nødvendigheden af individuelt analysere hver celle og kravet om Konfokal eller Super-resolution mikroskopi.
Her viser vi en høj-indhold receptor menneskehandel assay, der er kompatible med primære neuronal kultur præparater30. Denne metode etiketter separat overflade og intracellulære receptor puljer af faste neuroner, gør det muligt præsentation af data som et forhold af normaliserede overflade eller internaliseret receptor tæthed til den samlede massefylde for at receptor. High-indhold karakteren af denne metode er ideel til screening flere behandlinger og/eller genotyper i en kort tidsramme, og kræver kun standard celle dyrkning og antistof inkubation ekspertise.
Kort, primære neuroner er vokset i standard 96-brønd mikroplader og derefter behandlet da dikteres af eksperimentelle design, inkuberes med primære antistoffer, vasket og fast. Cellerne inkuberes derefter med en sekundær antistof at mærke overflade receptorer, efterfulgt af en anden fiksering trin. Permeabilization derefter opstår og en anden sekundær antistof bruges til at mærke interne receptor swimmingpools. Endelig er celler afbildet ved hjælp af en infrarød fluorescerende mikrotiterplade scanner til at kvantificere den integrerede befolkningstæthed hver receptor. Figur 1 opsummerer vores high-indhold analyse i forhold til en traditionel biotinylation assay.
Mens protokollen, der tilbydes her er optimeret og specifikke for AMPA-receptoren handel med primære hippocampus neuron kulturer, blive denne procedure kunne i teorien, udvidet og tilpasset forskellige receptorer i en lang række celletyper.
AMPA-receptorer er en ionotropic glutamat receptor subtype, som er en integreret del af neuronal funktioner, som omfatter synapse dannelse, synapse stabilitet og synaptisk plasticitet. AMPA-receptoren forstyrrelser er knyttet til flere neurologiske24 og anses for attraktive drug mål40. For eksempel, har undersøgelser vist, at en af de tidligste tegn på Alzheimers sygdom (AD) er synapse tab og reduceret synaptic AMPA-receptoren niveauer41,42. Intriguingly, svækker tilsætning af Amyloid-ß oligomerer overfladen GluA1-holdige AMPA receptor udtryk på synapser43. Yderligere, status epilepticus ned-regulerer GluA2 mRNA og protein i hippocampus neuroner forud for deres død44. Amyotrofisk lateral sklerose (ALS), TAR DNA-bindende protein (TDP-43) patologi, en ALS-specifikke molekylære abnormitet, har været knyttet til ineffektive GluA2 Q/R site-RNA redigering45.
High-indhold AMPA-receptoren menneskehandel analysen giver et effektivt middel til at måle bulk ændringer i receptor menneskehandel profiler inden for et neuronal netværk som svar på forskellige faktorer, indtager meget mindre tid og materialer end alternative metoder. En enkelt 96-brønd mikrotiterplade giver mange brønde til at køre flere tekniske replikater og styrer for forskellige eksperimentelle betingelser i den samme plade. Lav plating tætheden af 2 x 104 celler/brønd i forhold til 5 x 105 celler/brønd tæthed reducerer antallet af dyr og materialeudgiften til hvert eksperiment (figur 1). Den infrarøde scanner kan billedet op til seks 96-brønd mikroplader ad gangen. Analysen kan også ændres til en 384-godt mikrotiterplade46, som bliver specielt værdifulde, hvis analysen er kørt på dyrebare prøver, der er vanskelige at opnå eller er dyre at kultur (fx menneskelige prøver og inducerede pluripotente stamceller). Hele analysen kan udfyldes og analyseret på samme dag, som sparer værdifuld tid (figur 1).
Nogle punkter skal anses for vellykket og effektiv gennemførelse af analysen. For det første er det vigtigt at forberede DHPG løsningen på den samme dag af neuron behandling. Undlad at genbruge eller fryse DHPG bestande. 4% paraformaldehyde/4% saccharose i PBS løsning bør også gøres frisk på den samme dag i eksperimentet. For det andet kontrolhullerne behandlet med TTX kun eller køretøjet er forpligtet til at sikre, at de observerede virkninger er bestemt til behandling. Det er også afgørende at omfatte wells behandlet med kun de sekundære antistoffer til kontrol for baggrunden fluorescens produceret af ikke-specifik binding. Bemærk, at det andet fiksering trin (følgende udvaskning af sekundære antistoffer) er nøglen til at reducere sekundær antistof baggrundseffekter og opnå effektiv mærkning af receptor underenheder.
Kompromiser og begrænsninger, som med enhver metode, der findes. Denne analyse giver ikke én celle (eller subcellulært) opløsning og giver ikke mulighed for real-time tracking af receptor handel ligesom andre metoder32,33,35. Derudover skal ordentlig pleje tages under trinnet permeabilization af neuroner, som denne metode vil være følsomme over for udsivning af intracellulære komponenter for overdreven permeabilization.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Zachary Allen for teknisk bistand. Dette arbejde blev støttet af Whitehall Foundation (Grant 2017-05-35) og Joes C. Arrington forskning indledning Grant Program (RIG-93) A.M.M. M.A.G. og D.W.Y. blev begge støttet af en Georgia State University Neurogenomics 2CI Fellowship.
Mouse monoclonal (RH95) anti-GluA1 N-terminal | EMD Millipore | Cat#MAB2263MI, RRID: AB_11212678, LOT#2869732 | |
Mouse monoclonal (6C4) anti-GluA2 | ThermoFisher Scientific | Cat#32-0300, RRID: AB_2533058, LOT#TE268315 | |
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-68070, RRID: AB_10956588, LOT#C60107-03 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Li-COR Biosciences | Cat# 926-32212, RRID: AB_621847, LOT#C60524-15 | |
(RS)-3,5-DHPG | Tocris Bio-Techne | Cat#0342 | |
Tetrodotoxin Citrate (TTX) | Tocris Bio-Techne | Cat#1069 | |
Poly-D-Lysine Hydrobromide (PDL) | Sigma-Aldrich | Cat#P7280-5X5MG | |
Saponin | ACROS Organics | Cat# 419231000 | |
B-27 Supplement (50 X), Serum Free | Gibco | Cat#17504044 | |
Glutamax Supplement | Gibco | Cat#35050061 | |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FUDR) | Sigma-Aldrich | Cat#F0503 | |
Gentamycin (10 mg/ml) | Gibco | Cat#15710064 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | Electron Microscopy Sciences | Cat#19210 | |
Sucrose (EP/BP/NF) | FisherScientific | Cat#S2500GM | |
Odyssey Blocking Buffer (TBS) | Li-COR | Cat#927-50003 | Refered to as "Blocking Buffer" in the protocol |
Cell Culture Grade Water | HyClone | Cat#SH30529.02 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | Cat#14190250 | |
Neurobasal Medium, minus phenol red | Gibco | Cat#12348017 | Referred to as "neuronal Media" in the protocol |
28 mm Diameter Syringe Filters, 0.2 µm Pore SFCA Membrane, Sterile | Corning | Cat#431219 | |
96-well Black/Clear and White/Clear Bottom Polystyrene Microplates | Corning | Cat#3603 | |
ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ ; RRID: SCR_003070 | |
FIJI (Fiji is Just ImageJ) | NIH | http://fiji.sc/ ; RRID: SCR_002285 | |
Odyssey CLx imaging system | Li-COR Biosciences |