In-vitro-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer verwenden, um die Dynamik der Proteinkomplexe auf einer Millisekunde Zeitskala studieren

Biologische Aktivitäten erfolgt letztlich durch Proteine, die meisten davon mit anderen für richtige biologische Funktionen interagieren. Mit einem rechnerischen Ansatz, der Gesamtbetrag der Protein-Protein-Interaktionen in der menschlichen wird voraussichtlich 650.000 ~¹und Störung dieser Interaktionen oft führt zu Krankheiten². Durch ihre entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zellulärer und organismal Prozessen wurden zahlreiche Methoden entwickelt, um Protein-Protein-Wechselwirkungen, wie Hefe-zwei-Hybrid, bimolekulare Fluoreszenz Komplementierung, Split-Luciferase studieren Ergänzung und co-Immunopräzipitation Assay³. Während diese Methoden gut entdecken und Bestätigung von Protein-Protein-Interaktionen sind, sie sind in der Regel nicht-quantitative und somit bieten nur begrenzte Informationen über die Affinität zwischen den Interaktionspartnern Protein. Quantitative Pulldown-Menüs können zur Messung der Bindungsaffinität (z. B. die Dissoziationskonstante K_d), aber es misst nicht die Kinetik der Bindung, noch kann es angewendet werden, wenn die K-_d sehr niedrig, da eine unzureichende ist Signal-Rausch-Verhältnis⁴. Surface Plasmon-Resonanz (SPR)-Spektroskopie quantifiziert die verbindliche Kinetik, aber es erfordert eine spezifische Oberfläche und Immobilisierung von einem Reaktionspartner auf der Oberfläche, die potenziell die Binding-Eigenschaft der Reaktanten⁵ändern können. Darüber hinaus ist es schwierig für SPR schnell Assoziation und Dissoziation Preise⁵messen, und es ist nicht angebracht, SPR verwenden, um die Charakterisierung der Veranstaltung zum Austausch von Protein-Untereinheiten in einem Proteinkomplex. Hier beschreiben wir eine Methode, die erlaubt Messraten von Protein komplexe Montage und Demontage auf einer Millisekunde Zeitskala. Diese Methode war wesentlich für die Bestimmung der Rolle von CUllin – Warnformate –Nedd8 –dIssociated Protein 1 (Cand1)als die F-Box Protein Austausch Faktor^6,7.

Cand1 regelt die Dynamik der Skp1•Cul1•F-Box-Protein (SCF) E3 Ligases, die zu der großen Familie von Cullin-RING Ubiquitin Ligases gehören. SKSF bestehen aus den cullin, Cul1, die das RING Domain Protein Rbx1 bindet, und eine austauschbare F-Box Protein, das Rekruten Substrate und Cul1 durch den Adapter Protein Skp1⁸bindet. Als eine E3-Ligase SCF katalysiert die Konjugation des Ubiquitin an seinem Substrat, und es ist aktiviert, wenn das Substrat durch die F-Box Protein rekrutiert und Cul1 des Proteins Ubiquitin-artigen Nedd8⁹geändert wird. Cand1 bindet unmodifizierten Cul1 und bei der Bindung, stört es sowohl der Verband der Skp1•F-Box-Protein mit Cul1 und die Konjugation von Nedd8 bis Cul1^10,11,12,13. Infolgedessen Cand1 schien ein Inhibitor der SCF Aktivität in vitro, aber Cand1 Mangel in Organismen verursacht Mängel, die eine positive Rolle des Cand1 schlägt bei der Regulierung der SCF Aktivitäten in Vivo^{14,15,16 , 17}. dieses Paradox erklärt sich schließlich durch eine quantitative Studie, die die dynamische Interaktionen zwischen Cul1, Cand1 und Skp1•F-Box-Protein enthüllt. Mit Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) Assays, die die Bildung der SCF und Cul1•Cand1 komplexe erkennen, der Assoziation und Dissoziation bewerten konstanten (k_auf und k_ab, beziehungsweise) wurden einzeln gemessen. Die Messungen ergaben, dass Cand1 und Skp1•F-Box Protein Form extrem engen Komplex mit Cul1, aber die k_aus der SCF durch Cand1 drastisch erhöht wird und die k_aus der Cul1•Cand1 wird drastisch erhöht Skp1•F-Box Protein^6,7. Diese Ergebnisse unterstützen die aus- und kritische Bestimmung der Rolle der Cand1 als ein Protein Austausch Faktor, der die Bildung von neuen SCF-komplexe durch recycling von Cul1 aus der alten SCF komplexe katalysiert.

Hier präsentieren wir Ihnen das Verfahren der Entwicklung und Verwendung der Bund-Assay, um die Dynamik der Cul1•Cand1 Komplex⁷zu studieren, und das gleiche Prinzip kann angewendet werden, um die Dynamik der verschiedenen Biomolekülen zu studieren. Bund tritt auf, wenn ein Spender freut sich mit der entsprechenden Wellenlänge, und ein Akzeptor mit Anregungsspektrums Überlappung der Spender Emissionsspektrum in einer Entfernung von 10-100 ist Å. Die angeregten Zustand wird in den Akzeptor, wodurch abnehmender Spender Intensität und Akzeptor Intensität¹⁸übertragen. Die Effizienz der Bund (E) hängt der Förster-Radius (R₀) und der Abstand zwischen Donor und Akzeptor Fluorophore (R) und zeichnet sich durch: E = R₀⁶/ (R₀ ⁶ + R⁶). Der Förster-Radius (R₀) hängt von einigen Faktoren, einschließlich der Dipol Winkelorientierung, die spektrale Überlappung der Donor-Akzeptor-paar und die Lösung verwendet,¹⁹. Um die Bund-Assay auf einem Fluorimeter gestoppt-Flow anwenden, die die Änderung der Spender Emission in Echtzeit überwacht und ermöglicht Messungen der schnelle k_auf und k_aus, ist es notwendig, effiziente Bund, Ergebnisse einer signifikanten Reduktion der Spender Emission. Daher gestalten effiziente Bund durch die Wahl der entsprechenden paar fluoreszierende Farbstoffe und Websites auf die Zielproteine um die Farbstoffe zu befestigen ist wichtig und in diesem Protokoll diskutiert werden.