Boyuna floresans mikroskobu ile nöronal hayatta kalma izleme
Summary
Burada, hayatta kalma tek hücre olarak izlemek ve önemli ölçüde hücre ölümünü tahmin değişkenleri tanımlamak için bir iletişim kuralı mevcut.
Abstract
Lysates veya birden fazla zaman noktalarda sabit hücreler topluluğu gerektiren standart sitotoksisite deneyleri, duyarlılık ve nöronal kaderini etkileyen faktörleri değerlendirmek için kapasitesi sınırlıdır. Bu deneyleri hücre ayrık zaman noktalarda ayrı nüfus gözlenmesi gerekir. Sonuç olarak, tek tek hücreleri prospektif ciddi puncta oluşumu veya protein mislocalization, gibi hücre altı olaylar hastalığın patojenik sürücüleri homeostatik yanıt olup ayrımcılık yeteneği sınırlı zaman içinde izlenemiyor, ya da sadece tesadüfi olaylar. Tek hücreli boyuna mikroskobu araştırmacı hayatta kalma nüfus arasındaki farklılıkları belirlemek ve nedensel ilişkileri gelişmiş hassasiyeti ile çizmek izin bu sınırlamalar üstesinden gelir. Bu video rehber tek hücreli hayatta kalma bir floresan protein marker ifade sıçan birincil kortikal nöronların ölçme deneyleri için temsil edici bir iş akışı açıklayacağım. Görüntüleyiciyi yüksek verimli transfections elde etmek, toplamak ve tek tek hücreler potansiyel izlemeyi etkinleştirme görüntüleri işlemek nasıl öğrenin ve nöron popülasyonları Cox orantılı tehlikeler analizi kullanarak göreli yaşama karşılaştırın.
Introduction
Anormal hücre ölümü kanser, ateş ve kontur1de dahil olmak üzere birçok hastalığın sürüş bir faktördür. Hücre ölümü için güçlü ve hassas deneyleri genişleterek veya daraltarak hücresel hayatta kalmak için bu bozuklukların karakterizasyonu yanı sıra tedavi stratejilerinin geliştirilmesi gereklidir. Şu anda hücre ölümü, doğrudan veya vekil işaretleri2Ölçme teknikleri düzinelerce vardır. Örneğin, hücre ölümü görsel yardımıyla seçerek ölü veya canlı hücre3leke hayati boyalar veya plazma zarı4,5,6 belirli fosfolipitler görünümünü izleme tarafından tespit edilebilir . Hücre içi bileşenleri veya hücresel metabolitleri hücresel dağılması üzerine medya içine serbest ölçülerini, hücre ölüm7,8için proxy olarak da kullanılabilir. Alternatif olarak, hücre canlılığı metabolik aktivite9,10değerlendirmek tarafından yaklaşık. Bu yöntemleri hücre survival değerlendirirken bir hızlı yol sağlar rağmen onlar uyarılar değildir. Her teknik kültürü tek tek hücreler ve hayatta kalma kendi benzersiz oranları arasında ayırt etmek imkansız rendering tek bir nüfus olarak gözlemler. Ayrıca, bu tür nüfus tabanlı deneyleri hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme dahil olmak üzere hücre ölümü için önemli olabilir faktörler ölçmek mümkün değildir. Birçok durumda, bu deneyleri ayrık zaman puan için sınırlıdır ve hücreler sürekli gözlem altında zaman içinde izin vermez.
Buna ek olarak, boyuna floresans mikroskobu doğrudan ve sürekli olarak bir tek hücre olarak11ölüm riski izler son derece esnek bir metodoloji var. Kısacası, boyuna floresans mikroskobu düzenli aralıklarla uzun bir süre hücre ölümü ve geliştirmek veya hücre ölümü bastırmak faktörler kesin tespitler izin, için izlenmesi gereken tek tek hücreleri binlerce sağlar. Kaidesi Yöntem geçici transfection veya hücre iletim flüoresan protein kodlama vektörleri ile içerir. Benzersiz yediemin ardından kurulan ve bu simgesel yapı ile ilgili olarak transfected her hücrenin konumu görüntü ve tek tek hücreler saat, gün veya hafta boyunca izlemek Kullanıcı sağlar. Bu görüntüleri ardışık olarak görüntülendiğinde, hücre ölümü floresan, Morfoloji ve parçalanma her hücre için ölüm zamanını atanması olanaklı kılmak hücre vücudun karakteristik değişiklikler tarafından işaretlenir. Hazard fonksiyonu tarafından belirlenen ölüm, hesaplanan oranı daha sonra nicelik arasında koşulları karşılaştırıldığında veya tekdeğişirli veya çok değişkenli Cox orantılı tehlikeler analiz12kullanarak hücresel özellikleri seçmek için ilgili. Birlikte, bu yaklaşımların oranları hücresel popülasyonlar arasında hücre ölümü ve hücre ölümü ve/veya hayatta kalma (Şekil 1) önemli ölçüde tahmin değişkenleri tanımlaması doğru ve objektif ayrımcılık etkinleştirin.
Bu yöntem her sonrası Mitotik hücre tür biçimleri kaplama çeşitli ve hayatta kalma izlemek için kullanılabilmesine rağmen bu iletişim kuralını transfecting ve fare kortikal nöronlar kültürlü bir 96-şey tabak içinde görüntüleme için koşullar anlatacağız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, doğrudan tek hücre olarak nöronal hayatta kalma izlemek için metodoloji sunulur. Ayrık zaman puan ve hücre tüm nüfus için sınırlı olan geleneksel deneyleri aksine hücre ölümü için çeşitli faktörlere hücresel morfoloji, protein ifade veya yerelleştirme, gibi sürekli değerlendirilmesi için bu yöntem sağlar ve nasıl her faktörü hücresel hayatta kalma ileriye dönük bir şekilde etkilediği belirleyebilirsiniz.
Bu metodoloji deneysel ihtiyaçlarını geniş …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Steve Finkbeiner ve üyeleri Finkbeiner lab robot mikroskobu öncü için teşekkür ederim. Biz de ilk yazılım görüntü işleme için gerekli ve sağkalım Analizi otomatik bina için Dan Peisach teşekkür ederim. Bu eser nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) R01-NS097542, Michigan Üniversitesi’nde Protein katlanır hastalığı girişimi ve Ann Arbor etkin ALS karşı için Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
Referências
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
