Övervakning Neuronal överlevnad via längsgående fluorescensmikroskopi
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att övervaka överlevnad på basis av encelliga och identifiera variabler som betydligt förutsäga celldöd.
Abstract
Standard cytotoxicitet analyser, som kräver insamling av lysates eller fasta celler vid flera tidpunkter, har begränsad känslighet och förmåga att bedöma faktorer som påverkar neuronala öde. Dessa analyser kräver observation av åtskilda populationer av celler vid diskret tidpunkter. Som ett resultat, kan inte enskilda celler följas prospektivt över tiden, starkt begränsa möjligheten att diskriminera huruvida subcellulär händelser, såsom puncta bildandet eller protein mislocalization, är patogena förare av sjukdom, homeostatiska svar, eller bara tillfällighet fenomen. Encelliga längsgående mikroskopi övervinner dessa begränsningar, så att forskaren att avgöra skillnader i överlevnad mellan populationer och dra kausala relationer med ökad känslighet. Denna video guide kommer att beskriva ett representativt arbetsflöde för experiment mäta encelliga överlevnad av råtta primära kortikala nervceller att uttrycka en fluorescerande protein markör. Betraktaren kommer att lära dig att uppnå hög verkningsgrad transfections, samla in och bearbeta bilder som gör det möjligt för blivande spårning av enskilda celler och jämför relativa överlevnaden av neuronala populationer med hjälp av Cox proportionella riskmodell analys.
Introduction
Onormal celldöd är en drivande faktor i många sjukdomar, inklusive cancer, neurodegeneration och stroke1. Robust och känsliga analyser för celldöd är avgörande för karakterisering av dessa sjukdomar, liksom utvecklingen av terapeutiska strategier för att utöka eller minska cellulära överlevnad. Närvarande finns det massor av tekniker för att mäta celldöd, antingen direkt eller via surrogat markörer2. Till exempel kan celldöd bedömas visuellt med hjälp av vitala färgämnen som selektivt färgar döda eller levande celler3, eller genom att övervaka uppkomsten av specifika fosfolipider på plasmamembranet4,5,6 . Mätningar av intracellulära komponenter eller cellulära metaboliter släpps ut i media på cellulära upplösning kan också användas som proxyservrar för cell död7,8. Alternativt, cellulära livskraft kan approximeras genom att bedöma metabolisk aktivitet9,10. Även om dessa metoder ger snabba sätt att bedöma cellöverlevnad, är de inte utan förbehåll. Varje teknik har påpekat kulturen som en enda population, vilket gör det omöjligt att skilja mellan enskilda celler och deras unika priser för överlevnad. Dessutom kan sådana populationsbaserade analyser inte mäta faktorer som kan vara viktiga för celldöd, inklusive cellulära morfologi, proteinuttryck eller lokalisering. I många fall, dessa analyser är begränsade till diskreta tidpunkter, och tillåter inte för kontinuerlig observation av celler med tiden.
Däremot är längsgående fluorescensmikroskopi en mycket flexibel metod som direkt och kontinuerligt övervakar risken för död på en enskild cell grund11. I korthet, gör längsgående fluorescensmikroskopi tusentals enskilda celler spåras regelbundet för längre perioder, vilket gör att exakta bestämningar av celldöd och de faktorer som förbättrar eller undertrycka celldöd. På dess bas innebär metoden den övergående transfection eller transduktion celler med vektorer kodning fluorescerande proteiner. En unik Mï upprättas sedan och varje transfekterade cellen i förhållande till detta landmärke tillåter användaren att bilden och spåra enskilda celler under loppet av timmar, dagar eller veckor. När dessa bilder visas sekventiellt, markeras celldöd av karakteristiska förändringar i fluorescens, morfologi och fragmentering av cell kroppen, möjliggör tilldelning av en tid av döden för varje cell. Det beräknade priset av död, bestäms av funktionen fara, kan sedan kvantitativt jämfört mellan villkor eller relaterade till Välj cellulära egenskaper med univariat eller multivariat Cox proportionella riskmodell analys12. Tillsammans, aktivera dessa synsätt den korrekta och objektiv diskrimineringen av celldöd bland cellulära populationer och identifiering av variabler som betydligt förutsäger celldöd och/eller överlevnad (figur 1).
Även om denna metod kan användas för att övervaka överlevnad i någon post mitotiska celltyp i en mängd olika plätering format, kommer detta protokoll beskriva villkoren för transfecting och imaging råtta kortikala nervceller odlade i en plattan med 96 brunnar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenteras metod att direkt övervaka neuronal överlevnad på basis av encelliga. I motsats till traditionella analyser för celldöd som är begränsade till diskreta tidpunkter och hela populationer av celler, denna metod möjliggör kontinuerlig bedömning av en mängd faktorer såsom cellulär morfologi, proteinuttryck eller lokalisering, och kan avgöra hur varje faktor påverkar cellulära överlevnad i ett blivande sätt.
Denna metod kan ändras för att passa en rad olika experi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Steve Finkbeiner och medlemmar av Finkbeiner labbet för banbrytande robotic mikroskopi. Vi tackar också Dan Peisach för byggnadens ursprungliga programvaran krävs för bildbehandling och automatiserad överlevnadsanalys. Detta arbete finansierades av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke (NINDS) R01-NS097542, University of Michigan Protein Folding Disease Initiative och Ann Arbor aktiva mot ALS.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
Referências
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
