Overvåking Neuronal overlevelse via langsgående fluorescens mikroskopi
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å overvåke overlevelse på encellede basis og identifisere variabler som predikerer betydelig celledød.
Abstract
Standard cytotoksisitet analyser, som krever samlingen av lysates eller fast celler på flere tidspunkt, har begrenset følsomhet og kapasitet til å vurdere faktorene som påvirker neuronal skjebne. Disse analyser krever observasjon av egen befolkningen i celler på atskilte tidspunkt. Resultatet kan ikke enkeltceller følges prospektivt over tid, sterkt begrense muligheten til å diskriminere om subcellular hendelser, for eksempel puncta formasjon eller protein mislocalization, er patogene driverne av sykdom, homøostatisk svar, eller bare tilfeldig fenomener. Encellede langsgående mikroskopi overvinner disse begrensningene, slik at forskeren til å finne forskjellen i overlevelse mellom bestander og tegne årsaksforhold med økt følsomhet. Denne video guide vil skissere en representant arbeidsflyt for eksperimenter måle encellede overlevelse av rotte primære kortikale nevroner uttrykke merketråd fluorescerende protein. Betrakteren vil lære å oppnå høy virkningsgrad transfections, samle inn og behandle bilder slik at potensielle sporing av individuelle celler, og sammenligne relative overlevelse av neuronal bestander Cox proporsjonal farer analyse.
Introduction
Unormal celledød er en drivende faktor i mange sykdommer, inkludert kreft, neurodegeneration og strek1. Robust og sensitive analyser for celledød er avgjørende for karakterisering av disse lidelsene, samt utvikling av strategier for utvider eller reduserer mobilnettet overlevelse. Det finnes dusinvis av teknikker for måling celledød, enten direkte eller via surrogat markører2. For eksempel kan celledød vurderes visuelt ved hjelp av vitale fargestoffer som selektivt flekker død eller levende celler3, eller ved å overvåke utseendet på bestemte fosfolipider på plasma membranen4,5,6 . Målinger av intracellular komponenter eller cellular metabolitter ut i media på mobilnettet oppløsning kan også brukes som proxyer for celle død7,8. Alternativt kan mobilnettet levedyktighet tilnærmes ved å vurdere metabolsk aktivitet9,10. Selv om disse metodene gir rask måte å vurdere celle overlevelse, er de ikke uten begrensninger. Hver teknikk observerer kulturen som en enkelt befolkning, gjengivelse det umulig å skille mellom individuelle celler og deres unike priser for å overleve. Videre er slik befolkningen-baserte analyser ikke måler faktorer som kan være viktige for celledød, inkludert mobilnettet morfologi, protein uttrykk eller lokalisering. I mange tilfeller disse analyser er begrenset til diskret tidspunkt og tillater ikke kontinuerlig observasjon av celler over tid.
Langsgående fluorescens mikroskopi er derimot en svært fleksibel metode som direkte og kontinuerlig overvåker risiko for død på en enkeltcelle basis11. I korte trekk kan langsgående fluorescens mikroskopi tusen individuelle celler spores regelmessig over lengre tid, slik at presise avgjørelser av celledød og faktorene som forbedrer eller undertrykke celledød. På sin base innebærer metoden forbigående transfection eller signaltransduksjon celler med vektorer koding fluorescerende proteiner. En unik tillitsforhold opprettes deretter, og plasseringen av hver transfekterte celle i forhold til dette landemerket lar brukeren image og spore individuelle celler i løpet av timer, dager eller uker. Når disse bildene vises etter hverandre, merkes celledød av karakteristiske endringer i fluorescens morfologi og fragmentering av cellen kroppen, aktivere tilordningen av gangen død for hver celle. De beregnede satsen av død, bestemmes av funksjonen fare, kan deretter kvantitativt forhold mellom vilkår eller relatert til Velg mobilnettet egenskaper univariate eller multivariabel Cox proporsjonal farer analyse12. Sammen kan disse metodene nøyaktig og objektive diskriminering av celledød blant mobilnettet populasjoner og identifikasjon av variabler som predikerer betydelig celledød og/eller overlevelse (figur 1).
Selv om denne metoden kan brukes til å overvåke overlevelse i en post mitotisk celle type i en rekke plating formater, vil denne protokollen beskrive transfecting og imaging rotte kortikale nevroner kultivert i en 96-brønns plate.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenteres metodikk direkte overvåke neuronal overlevelse på encellede basis. I motsetning til tradisjonelle analyser for celledød som er begrenset til diskret tidspunkt og hele populasjoner av celler, gir denne metoden kontinuerlig vurdering av en rekke faktorer som mobilnettet morfologi, protein uttrykk eller lokalisering, og kan bestemme hvordan hver faktor påvirker mobilnettet overlevelse i en potensiell måte.
Denne metoden kan endres for å passe en rekke eksperimentelle behov. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Steve Finkbeiner og medlemmer av Finkbeiner laboratorium for banebrytende robot mikroskopi. Vi takker også Dan Peisach for den første programvaren kreves for bildebehandling og automatisert overlevelse analyse. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute for nevrologiske lidelser og strek (NINDS) R01-NS097542, Universitetet i Michigan Protein Folding sykdom initiativ og Ann Arbor aktive mot ALS.
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
Referências
- Lockshin, R. A., Zakeri, Z. Cell death in health and disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 11, 1214-1224 (2007).
- Kepp, O., Galluzzi, L., Lipinski, M., Yuan, J., Kroemer, G. Cell death assays for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 10, 221-237 (2011).
- Lemasters, J. J., et al. The mitochondrial permeability transition in cell death: a common mechanism in necrosis, apoptosis and autophagy. Biochimica et Biophysica Acta Bioenergetics. , 177-196 (1998).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. Journal of Immunological Methods. 184, 39-51 (1995).
- Chien, K. R., Abrams, J., Serroni, A., Martin, J. T., Farber, J. L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. Journal of Biological Chemistry. 253, 4809-4817 (1978).
- Zwaal, R. F. A., Comfurius, P., Bevers, E. M. Surface exposure of phosphatidylserine in pathological cells. Cell and Molecular Life Sciences. 62, 971-988 (2005).
- Mitchell, D. B., Santone, K. S., Acosta, D. Evaluation of cytotoxicity in cultured cells by enzyme leakage. Journal of Tissue Culture Methods. 6, 113-116 (1980).
- Moran, J. H., Schnellmann, R. G. A rapid beta-NADH-linked fluorescence assay for lactate dehydrogenase in cellular death. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 36, 41-44 (1996).
- Mossman, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Guerzoni, L. P. B., et al. In Vitro Modulation of TrkB Receptor Signaling upon Sequential Delivery of Curcumin-DHA Loaded Carriers Towards Promoting Neuronal Survival. Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).
- Arrasate, M., Finkbeiner, S. Automated microscope system for determining factors that predict neuronal fate. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 102, 3840-3845 (2005).
- Christensen, E. Multivariate survival analysis using Cox’s regression model. Hepatology. 7, 1346-1358 (1987).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, 677-685 (2014).
- Barmada, S. J., et al. Amelioration of toxicity in neuronal models of amyotrophic lateral sclerosis by hUPF1. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 112, 7821-7826 (2015).
- Malik, A. M., et al. Matrin 3-dependent neurotoxicity is modified by nucleic acid binding and nucleocytoplasmic localization. Elife. 7, (2018).
- Archbold, H. C., et al. TDP43 nuclear export and neurodegeneration in models of amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. Scientific Reports. 8, 4606 (2018).
- Green, K. M., et al. RAN translation at C9orf72-associated repeat expansions is selectively enhanced by the integrated stress response. Nature Communications. 8, 2005 (2017).
- Park, S. -. K., et al. Overexpression of the essential Sis1 chaperone reduces TDP-43 effects on toxicity and proteolysis. PLOS Genetics. 13, e1006805 (2017).
- Gupta, R., et al. The Proline/Arginine Dipeptide from Hexanucleotide Repeat Expanded C9ORF72 Inhibits the Proteasome. eNeuro. 4, (2017).
- Angelov, B., Angelova, A. Nanoscale clustering of the neurotrophin receptor TrkB revealed by super-resolution STED microscopy. Nanoscale. 9 (28), 9797-9804 (2017).
