अनुदैर्ध्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ंयूरॉन अस्तित्व की निगरानी
Summary
यहां, हम एक एकल सेल के आधार पर अस्तित्व की निगरानी और चर कि काफी सेल मौत की भविष्यवाणी की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।
Abstract
मानक cytotoxicity परख है, जो एकाधिक समय बिंदुओं पर lysates या निश्चित कोशिकाओं के संग्रह की आवश्यकता है, सीमित संवेदनशीलता और कारकों का आकलन करने के लिए क्षमता है कि ंयूरॉंस भाग्य प्रभाव । इन परख असतत समय अंक में कोशिकाओं के अलग आबादी के अवलोकन की आवश्यकता है । एक परिणाम के रूप में, व्यक्तिगत कोशिकाओं को समय के साथ संभावित रूप से पीछा नहीं किया जा सकता, बुरी तरह puncta गठन या प्रोटीन स्थानीयकरण के रूप में उपसेलुलर घटनाओं, कि भेदभाव करने की क्षमता सीमित, रोग के रोगजनक ड्राइवरों, समस्थिति प्रतिक्रियाओं, या महज संयोग की घटनाएं । एकल सेल अनुदैर्ध्य माइक्रोस्कोपी इन सीमाओं पर काबू पा, शोधकर्ता आबादी के बीच अस्तित्व में मतभेद निर्धारित करने के लिए और बढ़ाया संवेदनशीलता के साथ कारण संबंधों को आकर्षित करने के लिए अनुमति देता है । इस वीडियो गाइड एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन मार्कर व्यक्त चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के एकल सेल अस्तित्व को मापने प्रयोगों के लिए एक प्रतिनिधि कार्यप्रवाह रूपरेखा होगी. दर्शक सीखना होगा कि कैसे उच्च दक्षता transfections प्राप्त करने के लिए, इकट्ठा करने और प्रक्रिया छवियों व्यक्तिगत कोशिकाओं के संभावित ट्रैकिंग को सक्षम करने, और ंयूरॉंस के सापेक्ष अस्तित्व की तुलना आबादी कॉक्स आनुपातिक खतरों विश्लेषण का उपयोग कर ।
Introduction
असामान्य कोशिका मृत्यु कैंसर, neurodegeneration सहित कई रोगों में एक ड्राइविंग कारक है, और1स्ट्रोक. मजबूत और संवेदनशील सेल मौत के लिए परख इन विकारों के लक्षण वर्णन के लिए आवश्यक हैं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विस्तार या सेलुलर अस्तित्व को कम करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास । वर्तमान में सेल मौत को मापने के लिए तकनीक के दर्जनों रहे हैं, या तो सीधे या किराए मार्करों2के माध्यम से । उदाहरण के लिए, कोशिका मृत्यु नेत्रहीन महत्वपूर्ण रंजक है कि चुनिंदा दाग मृत या जीवित कोशिकाओं3, या प्लाज्मा झिल्ली4,5,6 पर विशिष्ट फॉस्फोलिपिड की उपस्थिति की निगरानी द्वारा की मदद से मूल्यांकन किया जा सकता . intracellular घटकों या सेलुलर विघटन पर मीडिया में जारी चयापचयों की माप भी सेल मौत7,8के लिए परदे के नीचे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, सेलुलर व्यवहार्यता चयापचय गतिविधि9,10का आकलन करके अनुमानित किया जा सकता है । हालांकि इन तरीकों सेल अस्तित्व का आकलन करने के तेजी से साधन प्रदान करते हैं, वे निरंतर बिना नहीं कर रहे हैं । प्रत्येक तकनीक एक ही आबादी के रूप में संस्कृति का निरीक्षण, यह असंभव को व्यक्तिगत कोशिकाओं और अस्तित्व के अपने अद्वितीय दरों के बीच अंतर प्रतिपादन । इसके अलावा, इस तरह की आबादी आधारित परख कारकों है कि सेल मौत के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है, सेलुलर आकृति विज्ञान, प्रोटीन अभिव्यक्ति, या स्थानीयकरण सहित उपाय करने में असमर्थ हैं । कई मामलों में, इन परख असतत समय अंक तक ही सीमित हैं, और समय के साथ कोशिकाओं की सतत अवलोकन के लिए अनुमति नहीं है ।
इसके विपरीत, अनुदैर्ध्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एक अत्यधिक लचीली पद्धति है जो सीधे और लगातार11एकल-कोशिका आधार पर मृत्यु के जोखिम पर नज़र रखता है । संक्षेप में, अनुदैर्ध्य प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी समय की विस्तारित अवधि के लिए नियमित अंतराल पर ट्रैक किया जा करने के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं के हजारों सक्षम बनाता है, सेल मौत के सटीक निर्धारण और कारकों है कि बढ़ाने या सेल मौत को दबाने की अनुमति. इसके आधार पर, विधि क्षणिक अभिकर्मक या कोशिकाओं के transductioning वैक्टर फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग के साथ शामिल है । एक अनूठा प्रत्यई तो स्थापित है, और इस ऐतिहासिकता के संबंध में प्रत्येक transfected सेल की स्थिति उपयोगकर्ता छवि के लिए अनुमति देता है और घंटे, दिन, या सप्ताह के पाठ्यक्रम पर व्यक्तिगत कोशिकाओं को ट्रैक । जब इन छवियों को क्रमिक रूप से देखा जाता है, कोशिका मृत्यु प्रतिदीप्ति, आकृति विज्ञान, और कोशिका शरीर के विखंडन में विशिष्ट परिवर्तन द्वारा चिह्नित है, प्रत्येक कोशिका के लिए मृत्यु के एक समय के असाइनमेंट को सक्षम करने. मौत की गणना की दर, जोखिम समारोह द्वारा निर्धारित, तो मात्रात्मक शर्तों के बीच तुलना में किया जा सकता है, या सेलुलर विशेषताओं का चयन करने के लिए संबंधित univariate या बहुभिंनरूपी कॉक्स आनुपातिक खतरों12विश्लेषण । एक साथ, इन दृष्टिकोण सेलुलर आबादी के बीच सेल मौत की दरों का सही और उद्देश्य भेदभाव सक्षम है, और चर की पहचान है कि काफी सेल मौत की भविष्यवाणी और/
हालांकि इस विधि को चढ़ाना प्रारूपों के एक किस्म में किसी भी पोस्ट-mitotic सेल प्रकार में अस्तित्व पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल transfecting और इमेजिंग चूहे cortical एक ९६-अच्छी तरह से थाली में कल्चरित ंयूरॉंस के लिए शर्तों का वर्णन करेंगे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, पद्धति को सीधे एक एकल कोशिका आधार पर ंयूरॉंस अस्तित्व पर नजर रखने के लिए प्रस्तुत किया है । कोशिका मृत्यु कि असतत समय अंक और कोशिकाओं की पूरी आबादी तक ही सीमित है के लिए पारंपरिक परख के विपरीत, इस व?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अग्रणी रोबोट माइक्रोस्कोपी के लिए स्टीव Finkbeiner और Finkbeiner लैब के सदस्यों को धंयवाद । हम भी प्रारंभिक छवि प्रसंस्करण और स्वचालित अस्तित्व विश्लेषण के लिए आवश्यक सॉफ्टवेयर के निर्माण के लिए दान Peisach धंयवाद । इस काम के लिए राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के लिए संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया (NINDS) R01-NS097542, मिशिगन प्रोटीन तह रोग पहल के विश्वविद्यालय, और एन आर्बर ALS के खिलाफ सक्रिय ।
Materials
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| CompactPrep Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12863 | |
| Magnesium chloride Hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| Kynurenic Acid Hydrate | TCI | H0303 | |
| Poly D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Glutamax | GIBCO | 35050-061 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 52887 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | A3582801 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140122 | |
| 96 well plates | TPP | 0876 |
Referências
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