Abnorme Zellen der Tod ist ein treibender Faktor in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs, Neurodegeneration und Takt¹. Robust und sensibel Assays für Zelltod sind unerlässlich, um die Charakterisierung dieser Störungen sowie die Entwicklung von therapeutischen Strategien zur Erweiterung oder Reduzierung der zellulären überleben. Derzeit gibt es Dutzende von Techniken zur Messung der Zelltod, entweder direkt oder durch Surrogat-Marker-². Zum Beispiel kann Zelltod visuell beurteilt werden mit Hilfe der lebenswichtige Farbstoffe, die tote oder lebende Zellen³selektiv beflecken oder durch das Auftreten von bestimmten Phospholipide auf der Plasmamembran^{4,5,6 Überwachung} . Messungen von intrazellulären Komponenten oder zellulären Metaboliten in den Medien auf zelluläre Auflösung freigegeben dient auch als Proxys für Zelle Tod^7,8. Alternativ kann zelluläre Lebensfähigkeit angenähert werden, durch die Beurteilung der Stoffwechselaktivität^9,10. Obwohl diese Methoden schnelle Mittel zur Bewertung der Zelle überleben bieten, sind sie nicht ohne Vorbehalte. Jede Technik beobachtet die Kultur als eine einzelne Population, wodurch es unmöglich, zwischen den einzelnen Zellen und ihre einzigartige Preise des Überlebens zu unterscheiden. Darüber hinaus können solche bevölkerungsbezogene Assays Faktoren messen, die für Zelltod, einschließlich zellulären Morphologie, Proteinexpression oder Lokalisierung wichtig sein können. In vielen Fällen diese Tests beschränken sich auf diskreten Zeitpunkten, und erlauben nicht die kontinuierliche Beobachtung von Zellen im Laufe der Zeit.

Im Gegensatz dazu ist längs Fluoreszenzmikroskopie eine hochflexible Methodik, die direkt und kontinuierlich das Risiko des Todes auf eine einzelne Zelle Basis^{11 überwacht}. In Kürze kann längs Fluoreszenzmikroskopie Tausende von einzelnen Zellen verfolgt werden in regelmäßigen Abständen über einen längeren Zeitraum hinweg, ermöglicht die präzise Bestimmung der Zelltod und die Faktoren, die zu verbessern oder zu unterdrücken, Zelltod. An der Basis umfasst der Methode die transiente Transfektion oder Transduktion von Zellen mit Vektoren fluoreszierende Proteine codieren. Eine einzigartige Treuhänder ist dann hergestellt, und die Position der einzelnen transfizierten Zellen in Bezug auf dieses Merkmal ermöglicht dem Benutzer, Bild und verfolgen Sie einzelne Zellen im Verlauf von Stunden, Tagen oder Wochen. Wenn diese Bilder nacheinander angezeigt werden, zeichnet sich Zelltod durch charakteristische Veränderungen in Fluoreszenz, Morphologie und Fragmentierung der Zellkörper, ermöglicht die Zuordnung von einer Zeit der Tod für jede Zelle. Die errechnete Rate des Todes, bestimmt durch die Hazard-Funktion kann dann quantitativ im Vergleich zwischen den Bedingungen oder im Zusammenhang mit zelluläre Eigenschaften mit univariaten und multivariaten Cox proportional Gefahren Analyse¹²auswählen. Zusammen ermöglichen diese Ansätze die genaue und objektive Diskriminierung der Preise des Zelltods bei der zellularen Bevölkerung sowie die Ermittlung der Variablen, die deutlich Zelltod und/oder überleben (Abbildung 1 Vorhersagen).

Obwohl diese Methode verwendet werden kann, zu überleben in jeder Post-mitotische Zelle Art in einer Vielzahl von Formaten Plattieren zu überwachen, wird dieses Protokoll Bedingungen für transfecting und imaging-Ratte kortikale Neuronen in einer 96-Well-Platte kultiviert beschreiben.