Singolo-velocità effettiva complementari ad alta risoluzione tecniche analitiche per la caratterizzazione di miscele complesse di sostanza organica naturale

Globalmente, le zone umide sono stimate a contengono Pg 529 del carbonio (C), principalmente come C organico seppellito in depositi di torba¹. Attualmente, tali torbiere agiscono come un lavandino C netto, sequestrante 29 Tg C y^-1 nel Nord America da solo¹. Tuttavia, disturbi ambientali come drenante, incendi, siccità e temperature più calde possono compensare questo sink C aumentando la decomposizione di materia organica con conseguente aumentata C perdite tramite gas serra (anidride carbonica [CO₂] e ^1,produzione di metano [CH₄])². Cambiamento climatico può contribuire alla perdita di C se temperature più calde o essiccatore condizioni stimolano più veloce C decomposizione da parte dei microrganismi. In alternativa, più alte temperature e concentrazioni in aria CO₂ possono stimolare la produzione primaria per sequestrare più CO₂ come carbonio organico (OC). In quale misura e quanto velocemente tale OC viene quindi scomposto in CO₂ e CH₄ dipende da complesse interazioni tra i substrati di donatore di elettrone, la disponibilità di accettori e i microrganismi che mediano il trasformazione. In molti casi, i meccanismi non sono ben caratterizzati, così loro risposta a perturbazioni ambientali non è ben vincolata e non è ancora chiaro quale sarà il risultato del cambiamento climatico sul bilancio del carbonio negli ecosistemi delle torbiere.

La natura complessa della materia organica naturale (NOM) ha fatto anche identificare i composti organici presenti nelle miscele NOM storicamente difficile. Gli avanzamenti recenti hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di caratterizzare i composti che tradizionalmente e, in qualche misura continua ad essere, considerato recalcitrante umico fulvico composti^3,4,o⁵. Ora capiamo che molti di questi composti sono in realtà microbica disponibili e può essere decomposto se un accettore di elettroni terminale adatto (TEA) è reso disponibile^6,7. Calcolare lo stato di ossidazione nominale del carbonio (NOSC) per un composto fornisce una metrica per predire il potenziale di decomposizione e il rendimento energetico del tè richiesto. Tuttavia, esso richiede una caratterizzazione a livello molecolare della materia organica⁷. NOSC è calcolato dalla formula molecolare tramite la seguente equazione⁷: NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4, dove z è la carica netta. NOSC è correlata con la termodinamica guida forza⁸, in cui composti con NOSC superiori sono più facili da degradare, mentre composti con bassa NOSC richiedono sempre più energico tè al fine di essere ridotto. Composti con NOSC inferiore a − 2 richiedono un’alta energia producendo tè come O₂, nitrato o Mn^IVe non può essere degradate da che si verificano comunemente più basso energia producendo tè come Fe^III o solfato⁷. Questa è una considerazione importante nelle condizioni anossiche impregnato d’acqua trovato nelle zone umide dove O₂ e altre ad alta energia producendo tè sono scarse⁹ e quindi la degradazione di composti NOSC inferiore in queste condizioni sono termodinamicamente limitato. Perturbazione ambientale può influenzare lo stato termodinamico dell’ecosistema attraverso i cambiamenti idrologici che influenzano O₂ (il più energico accettore di elettroni), cambiamenti in substrati organici e accettori messi a disposizione dal principale produzione e in misura minore dalla temperatura. Un esempio importante degli effetti di temperatura nei sistemi di zona umida si verifica per quanto riguarda il compromesso che si verifica tra homoacetogenesis (cioè, produzione di acetato da CO₂ e H₂) e hydrogenotrophic metanogenesi ( cioè, produzione₄ CH da CO₂ e H₂). A basse temperature, sembra che homoacetogenesis è leggermente favorito, mentre temperature più calde favoriscono CH₄ produzione¹⁰. Questo effetto di temperatura può avere implicazioni importanti per la risposta degli ecosistemi al cambiamento climatico, come CH₄ è un gas serra molto più forte di CO₂¹¹ e quindi aumentare la produzione di CH₄ a spese di CO₂ alle temperature più calde può contribuire ad un feedback positivo con il riscaldamento climatico.

Le torbiere producono globalmente significative quantità di CO₂ e CH₄⁶tramite respirazione microbica di biofiltri organici importa. NOSC dei substrati organici carbonio determina la proporzione relativa di CO₂: CH₄ prodotto che è un parametro critico a causa del maggiore forcing radiativo di CH₄ rispetto al CO₂¹¹, ma anche perché sforzi modellanti hanno identificato questo rapporto come un parametro critico per la stima C flusso in torbiere¹². In assenza di accettori terminali diverso da CO₂, può essere dimostrato dall’equilibrio di elettroni che substrati organici C con volontà > 0 NOSC producano CO₂: CH₄ > 1, C organico con NOSC = 0 produce CO₂ e CH₄ in rapporto equimolare e C organico con NOSC < 1 produrrà CO₂: CH₄ < 1¹³. Decomposizione di OC negli ecosistemi naturali è mediata da microrganismi, così che anche quando la degradazione di un composto specifico è thermodinamicamente fattibile, cineticamente è limitato dall’attività di enzimi microbici e, in condizioni anossiche, per la forza motrice termodinamico (cioè, NOSC)⁷. Fino ad ora esso è stato impegnativo per caratterizzare completamente la materia organica, perché la diversità dei composti presenti richiede diverse tecniche complementari per la loro caratterizzazione. Gli avanzamenti recenti hanno chiuso il gap; utilizzo di una suite di tecniche analitiche possiamo analizzare una vasta gamma di composti organici fornendo la caratterizzazione a livello molecolare e, in alcuni quantificazione di casi, da piccoli metaboliti primari come il glucosio fino a 800 Da poli-eterocicli. In precedenza tali grandi molecole complesse sarebbero sono state caratterizzate semplicemente come lignina-come o tannino-come e presupposto per essere stato ricalcitrante. Caratterizzazione molecolare-livello, tuttavia, consente il calcolo di NOSC per anche queste grandi molecole complesse. Questi valori NOSC sono correlati linearmente con la forza motrice termodinamica che permettano una valutazione della qualità della sostanza organica disponibile per decomposizione, che in molti casi rivela che queste molecole complesse possono effettivamente essere microbica degradabile anche sotto le condizioni anossiche che prevalgono nelle zone umide.

Poiché introduzione di O₂ permette di materia organica di quasi tutti i valori NOSC naturalmente osservati per essere decomposto, qui ci concentriamo sui cambiamenti nella materia organica e proteomica microbica che rischiano di essere i driver primari in zona umida (cioè, sistemi di limitata O₂). Tuttavia, tutte le tecniche che si discuterà possono essere applicate alla materia organica da qualsiasi ecosistema. Comunemente, misurazioni di massa sulla basano ottica, e l’analisi di fluorescenza sono stati usati per valutare la qualità di materia organica^3,14. Quando si utilizza bulk misure come queste, tuttavia, dettagli raffinati sono persi come un numero elevato di molecole Classificato insieme in termini generici come humics o fulvics. Le definizioni di queste categorie non sono vincolate e, infatti, possono variare da studio a Studio facendo paragoni impossibili. Inoltre, misurazioni di massa non forniscono i dettagli molecolari necessari per calcolare la termodinamica che regolano il sistema e pertanto sono privi veramente valutare qualità di materia organica¹⁵.

Tecniche individuali come Fourier trasformano ionica a risonanza ciclotronica (FTICR-MS), spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR), gas cromatografia spettrometria (GC-MS) di massa e fare liquido cromatografia spettrometria di massa (LC-MS) fornire tali dettagli a livello molecolare. Mentre ciascuna di queste tecniche presenta le proprie limitazioni, portano anche i propri punti di forza che può essere sfruttati in un approccio integrato per raggiungere i minimi dettagli molecolari necessari per quantificare la qualità di materia organica in un rigoroso senso termodinamico . GC-MS è utile per l’identificazione dei metaboliti piccole critiche che possano avere influenza prossimale il CO₂ e produzione di₄ CH (per esempio, glucosio, acetato, ecc.); Tuttavia, GC-MS richiede la verifica rispetto a uno standard ed è quindi limitato ai già noti composti presenti nel database impedendo l’identificazione di nuovi composti. Inoltre, GC-MS è una tecnica semi-qualitativa permettendo inferenza circa i cambiamenti nelle concentrazioni relative, ma non fornisce le informazioni di effettiva concentrazione necessarie per il calcolo ad esempio energie libere di Gibb. Infine, GC-MS richiede derivatizzazione di molecole prima dell’analisi che limita la risoluzione a composti più ~ 400 Da piccolo e alcoli volatili vengono perse durante la fase di asciugatura.

Unidimensionale (1D) ¹H stato liquido NMR permette la caratterizzazione altamente quantitativa dei piccoli metaboliti (compresi i metaboliti primari piccolo peso molecolare e composti volatili come acetato, alcool, acetone, formiato, piruvato, succinato, gli acidi grassi a catena corta, come pure una gamma di carboidrati notoriamente assente o compromesse da metodi basati su MS) e le loro concentrazioni sono particolarmente utili per il calcolo dei parametri termodinamici. Eppure, come GC-MS, NMR 1D di miscele complesse richiede standardizzazione rispetto a un database e pertanto non solo permettono una facile identificazione di nuovi composti che rischiano di essere abbondanti in ecosistemi naturali e mutevoli complessi. Inoltre, è meno sensibile che le tecniche basate su MS NMR e dunque, profiling del metabolita quantitativa è realizzato solo di sopra di 1 µM mediante NMR sistemi dotati di sonde-freddo raffreddato ad elio. Non ampiamente apprezzato, alcuni NMR freddo-sonde sono sale-tolleranti e consentono un’analisi ambientale miscela in presenza di concentrazioni millimolar sale quando utilizzato in più piccolo diametro (< 3 mm di diametro esterno) campione tubi¹⁶. Tuttavia, un’ulteriore complicazione di RMN è che elevate quantità di minerali e metalli paramagnetici (ad es., Fe e Mn sopra 1-3 wt %), che può essere abbondante nei terreni di montagna, può ampliare le caratteristiche spettrali e complicano l’interpretazione degli spettri NMR . Mediante estrazione in fase solida (SPE) possono contribuire all’interpretazione di NMR e MS-based metabolomica metodi riducendo i sali minerali e aumentando la qualità spettrale.

FTICR-MS di iniezione diretta è una tecnica altamente sensibile in grado di rilevare decine di migliaia di metaboliti da un unico campione, ma non acquisisce i metaboliti di piccoli critici come succinato, piruvato e acetato ed è notoriamente difficile da utilizzare per gli zuccheri e altri carboidrati¹⁷, né fornisce informazioni quantitative. Tuttavia, a differenza di altre tecniche, FTICR-MS eccelle all’individuazione e assegnazione formula molecolare di nuovi composti e identifica pertanto il maggior numero di composti che fornisce informazioni più molecolare rispetto a qualsiasi delle altre tecniche descritte. Questo è utile, perché le informazioni molecolari fornite da FTICR-MS (e altre tecniche) possono essere utilizzate per calcolare NOSC è imparentato con la forza motrice termodinamica che disciplinano la probabilità di determinate reazioni⁸ e le loro tariffe in determinate condizioni⁷. Inoltre, accoppiando FTICR-MS con tecniche di separazione, come LC insieme a tandem MS, informazioni strutturali quantitative possono essere raggiunti, compensare alcuni degli svantaggi di questa tecnica. LC-MS è utile per identificare composti lipido-simili e altri metaboliti che non sono ben caratterizzati da uno qualsiasi degli altri metodi. FTICR LC-MS o LC-MS di accoppiamento con un collezionista di frazione e raccogliendo le frazioni di incognite specifici di interesse per la delucidazione strutturale dallo stato liquido di bidimensionale (2D) NMR è la situazione ideale per identificare e quantificare i composti sconosciuti^{18 ,19}. Tuttavia, questo è un passo molto che richiede tempo che potrebbe essere utilizzato se e quando necessario. Presi singolarmente, ognuna di queste tecniche forniscono un’istantanea differente della materia organica, e integrandoli, possiamo raggiungere una comprensione più completa rispetto all’utilizzo di qualsiasi tecnica di isolamento.

Mentre le considerazioni termodinamiche impostano i vincoli ultimati su quali trasformazioni sono possibili in un sistema, decomposizione di materia organica è mediata dai microrganismi di cui attività enzimatiche controllare la velocità di reazione. Quindi, comprendere pienamente i controlli sulla decomposizione di materia organica e, in definitiva, produzione di gas (CO₂ e CH₄) Serra da zone umide richiede un approccio integrato omics alla che caratterizzano l’attività degli enzimi microbici, nonché i metaboliti. In questo articolo, descriviamo un metodo per il raggiungimento di tali un’analisi completa da un unico campione utilizzando un approccio sequenziale che si traduce in un’analisi completamente accoppiata. Questo approccio consente di espandere il metabolita, la proteina ed il protocollo di estrazione (MPLex) del lipido in cui proteomica è stato accoppiato con GC-MS e LC-MS²⁰ per identificare piccoli metaboliti, proteine e lipidi incorporando informazioni quantitative metabolita via NMR e identificazione dei maggiori metaboliti secondari tramite FTICR-Sig. ra leggermente diverso da MPLex, iniziamo il protocollo con l’estrazione di acqua e quindi uso sequenziale estrazione con solventi non polari sempre più. Tutte le estrazioni sono effettuate su un campione unico che conserva il campione quando i volumi sono limitati o difficili da ottenere e diminuisce l’errore sperimentale introdotto attraverso variazioni tra le aliquote da matrici di campioni eterogenei (ad es., terreno e torba) o differenze nelle condizioni di conservazione e durata.

Infine, accoppiando le analisi di OM con analisi proteomica della comunità microbica, possiamo costruire reti metaboliche che descrivono le vie e la trasformazione di decomposizione di materia organica. Questo ci permette di testare ipotesi specifiche sull’influenzano di perturbazioni al sistema ultimate CO₂ e produzione₄ CH attraverso alterazione i substrati organici disponibili, accettori e comunità microbiche mediando le reazioni tramite l’attività di catalizzatori di enzima.

L’obiettivo generale di questo metodo è quello di fornire un protocollo di singola velocità effettiva per l’analisi dei metaboliti, lipidi e proteine microbiche da un singolo campione creando un dataset completamente accoppiato per la costruzione di reti metaboliche mentre vincolando gli errori analitici .