Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen
Summary
Hier beschreiben wir, wie die automatisierte Screening und Sammlung Datenoptionen verfügbar bei einigen Synchrotron Beamlines verwenden. Wissenschaftler senden Cryocooled Proben an der Synchrotron und die Beugung Eigenschaften gezeigt, die Datensätze gesammelt und verarbeitet werden und, soweit möglich, erfolgt eine Struktur-Lösung – ganz ohne menschliches Zutun.
Abstract
Hohe Brillanz Röntgenstrahlen gepaart mit Automatisierung führten zu die Verwendung von Synchrotron-basierte makromolekularen Röntgen-Kristallographie (MX) Beamlines sogar die anspruchsvollsten Projekte in Strukturbiologie. Jedoch erfordern die meisten Einrichtungen noch das Vorhandensein eines Wissenschaftlers vor Ort die Experimente durchführen. Eine neue Generation von automatisierten Beamlines widmet sich der vollautomatische Charakterisierung und Datenerfassung aus, Kristalle von biologischen Makromolekülen hat vor kurzem entwickelt. Diese Beamlines vertreten ein neues Tool für Strukturbiologen der Ergebnisse der ersten Kristallisation Studien und/oder die Sammlung einer großen Anzahl von Datensätzen Beugung, ohne sich zu beherrschen, das Strahlrohr auf den Bildschirm. Hier zeigen wir wie ein Experiment für das automatische Screening und Datenerfassung, eingerichtet wie ein Experiment auf das Strahlrohr durchgeführt wird, wie die resultierenden Datensätze verarbeitet werden, und wie, wenn möglich, die Kristallstruktur des biologischen Makromolekül gelöst.
Introduction
Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von bestimmten Proteinen ist entscheidend in der Biologie. Die Informationen, die dabei abgeleitet ist beleuchtet so auf die biologische Funktion und auf die Form und die Spezifität der aktiv und verbindlich Websites enthalten im Molekül unter Studie. In vielen Fällen dadurch Wirkmechanismen ermittelt werden oder gegebenenfalls mögliche therapeutische Moleküle entwickelt werden. MX ist die am häufigsten verwendeten strukturellen Informationen zu Technik, sondern ein Engpass ist die Bestimmung des optimalen Bedingungen gut diffracting Kristalle zu erhalten. Daher Kristallisation Studien sind in zahlreichen unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt und dann gezeigt werden, um die besten Kristalle zur Beugung Datenerfassung verwendet werden zu finden. Die Automatisierung des Aufbaus der Kristallisation Studien1 hat in dieser Hinsicht eindeutig geholfen. Jedoch sind die nachfolgenden Schritte (z.B. Kristall Montage, Beugung Screening und Beugung Datenerhebung) in der Regel manuell durchgeführt nimmt einiges an Zeit, Aufwand und Ressourcen. Die Automatisierung der Beugung Screening und Datenerfassung würde daher einen enormen Gewinn an Zeit und Effizienz bedeuten.
Beugung-Screening und Datenerfassung in MX am häufigsten Synchrotron MX Beamlines erfolgt auf auf die Automatisierung dieses Prozesses weitgehend erleichtert hat. In den meisten Fällen ist es jedoch notwendig für den Wissenschaftler in das Strahlrohr während eines Experiments anwesend oder es aus der Ferne bedienen. Vor kurzem wurde eine neue Generation der vollautomatischen MX Beamlines entwickelt2. Hier müssen Benutzer nicht körperlich oder aus der Ferne, während einer experimentellen Sitzung anwesend sein. Dies ermöglicht es Wissenschaftlern, mehr Zeit auf weniger Routineaufgaben, anstatt verbringen ganze Tage und oft Nächte, Screening-Kristalle und Beugung Datenerhebung. Der weltweit erste vollautomatische Strahlrohr ist massiv automatisierten Probe Auswahl integrierter Facility (massiv-1, ID30A-1)2,3 der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF). Es verfügt über ein einzigartiges Beispiel Umfeld eine Hochleistungs-Probe-haltigen Dewar im Tandem mit einem Roboter Probenwechsler, das auch als das Strahlrohr Goniometer4,5fungiert. MASSIV-1 ist ein Undulator Strahlrohr ausgerüstet mit einer Single-Photon-zählen Hybrid Pixel Detektor6, das bei einer festen Wellenlänge von 0,969 betreibt Å (12.84 keV) mit einer intensiven Röntgenstrahl (2 x 1012 Photonen/s). Die Strahlgröße bei den Probenort kann zwischen einem Minimum von 10 µm (Runde Balken) zu einem Maximum von 100 µm X 65 µm (Horizontal durch vertikale Balken Größe) eingestellt werden. Im Durchschnitt kann das Strahlrohr zu verarbeiten, in eine vollautomatische Mode (siehe unten), 120 Kristalle in 24 h. Der Betrieb das Strahlrohr basiert auf eine Reihe von Workflows7, von denen jeder intelligente Entscheidungen basierend auf dem Ergebnis der vorherigen Schritte im Workflow braucht, um die Messung der möglichen Daten aus der Probe unter Studie zu gewährleisten. Insbesondere die Bewertung der Beugung Merkmale einer einzelnen Probe Konto Kristall Volumen und Flussmittel berücksichtigt und gewährleistet, wo der Kristall ist größer als der Röntgenstrahl, dass nur die beste Region des Kristalls für nachfolgende Daten verwendet wird Kollektion. Beugung von Datensätzen sind, so optimiert für maximale Auflösung mit minimierter Strahlung Schaden2,3. Anspruchsvolle Sammlung Datenprotokollen, wie Pseudo-spiralförmige (Multi-Positionsdaten) Sammlung Strategien für beide native und Einzel-Wellenlänge anomale Beugung (SAD) Datenerhebung sind auch verfügbar8.
Vollautomatische Experimente bei massiv-1 umfassen Cryocooling und Montage der Kristalle auf einer magnetischen Probe Halterung geeignet für den gewünschten Strahlrohr Ausrüstung Standard pins SPINE9, Eingabe der gewünschten experimentellen Parameter in der “Beugung Plan “Tabelle in das integrierte System für Proteinkristallographie Beamlines (ISPyB)10, ein Web-basiertes Informationsmanagementsystem für MX-Experimente, und senden Sie die Proben an das Strahlrohr. Bei der ESRF, alle Kosten für den Transport der Proben von/nach das Strahlrohr von der ESRF User Office unterstützt werden (siehe die Website der ESRF11 für Details). MASSIV-1, sind keine Beschränkungen auf die Schleifengröße oder Kristallqualität. Bei der Auswahl eines Beugung Plans für einen bestimmten Kristall kann der Benutzer Standardeinstellungen verwenden oder wählen Sie aus speziellen Workflows, die für jede Probe angepasst werden können. Es stehen mehrere vorprogrammierte Abläufe. Im MXPressE3 -Workflow wird die Probe-haltigen Schleife zuerst den Probenort mit optische Zentrierung ausgerichtet. Dann, X-ray-basierten Zentrierung gewährleistet, dass die beste Region des Kristalls zu den Röntgenstrahl zentriert ist. Daten-Sammlung-Strategien werden dann mit eEDNA, einen Rahmen für die Entwicklung von Plugin-basierten Anwendungen speziell für Online-Datenanalyse im Feld x-ray Experimente unter Konto Kristall Volumen und der Echtzeit-Flux auf das Strahlrohr berechnet. Im Anschluss an die Sammlung eines Datensatzes volle Beugung dies werden dann mit eine Reihe von automatischen Datenverarbeitung Rohrleitungen12 verarbeitet und die Ergebnisse werden im ISPyB für Inspektion und Download zur Verfügung gestellt. MXPressE SAD3 Workflow richtet sich an Selenomethionin-haltigen Kristalle des Zielproteins und nutzt die Tatsache, dass die Antriebsenergie von massiv-1 oberhalb der Se K-Kante. Hier der MXPressE eEDNA Sammlung Datenstrategie für traurig Datenerfassung optimiert ist (d. h. hohe Redundanz und mit der Auflösung von wo RZusammenführung zwischen Bijvoet Paaren unter 5 % liegt). Die Beugung Eigenschaften einer Reihe von Kristallen ohne nachträgliche Datenerfassung auf dem Bildschirm, kann die MXScore3 Workflow verwendet werden, um eine Aussage über die Kristalle analysiert voller Qualität zu produzieren. Im MXPressI3 Workflow 180° Drehung Daten gesammelt werden, mit 0,2 ° Schwingungen und mit den Startwinkel Phi und die Auflösung durch eine eEDNA Strategie bestimmt. MXPressO 3 enthält eine preobserved Auflösung in den Workflow (Standard: dmin = 2 Å). Um eine erste Einschätzung der Kristalle aus einer Kristallisation Test zu machen, wird die MXPressM3 Workflow angeboten. Dies führt eine Hochdosis-Netz über die breiteste Ausrichtung der Probenträger keine Datenerfassung scannen oder zentrieren. Vor kurzem wurden zwei neue Experiment-Workflows, MXPressP und MXPressP_SAD, die pseudohelical Datenerhebungen durchführen, implementierte8. Die Ausführung aller Schritte in allen Workflows kann online und in Echtzeit verfolgt werden durch den Benutzer, über ISPyB.
Hier zeigen wir eine vollautomatische MX-Experiment am massiv-1 vorbereiten und Gewusst wie: abrufen und analysieren der Daten, die aus dem Experiment. Als Beispiel verwenden wir menschliche Mitochondrien Glycin Spaltung System Protein H (GCSH). Dieses Lipoic Säure-haltige Protein ist Teil des Systems der Glycin-Spaltung verantwortlich für den Abbau von Glycin. Dieses System beinhaltet das P-Protein, einem Pyridoxal-Phosphat-abhängigen Glycin-Decarboxylase T-Protein, ein Enzym Tetrahydrofolate erfordern und das L Protein, ein Lipoamide-Dehydrogenase. GCSH überträgt die Methylamin-Gruppe von Glycin aus dem P-Protein mit dem T-Protein. Mängel in der H-Protein sind die Ursache für Nonketotic Hyperglycinemia (NKH) Menschen13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vollautomatische Beamlines bieten automatisierte Charakterisierung und Datenerfassung von großen Zahlen von makromolekularen Kristalle ohne die Anwesenheit eines Wissenschaftlers, entweder auf das Strahlrohr oder aus der Ferne, erforderlich. Mit vollständig automatisierten Beamlines hat viele Vorteile im Vergleich zum manuellen Betrieb. Für Beispiel, die automatisierte Probe zentrieren, auf x-ray Netz basierend und Linie scannt, ist genauer als das mit dem menschlichen Auge als wird es nicht durch thermische oder optische Effekte beeinflusst. In der Tat bieten diese Masche und Linie Scans Zusatzdaten (z.B. detaillierte Abmessungen des Kristalls und die besten Interferenzgitters Region des Kristalls) sind wichtig bei der Bestimmung der richtigen Strahlgröße zur Datenerfassung nutzen – vor allem für kleine Kristalle 18– und oft eine bessere Qualität der erhaltenen Beugung Daten führen. Darüber hinaus können unter Ausnutzung der benutzerdefinierten Parameter in der Einrichtung von automatischen Experimenten die Schritte in spezifischen Arbeitsabläufe zugeschnitten werden am besten das System untersucht, damit die Erfolgsrate Experiment weiter zu optimieren.
Nimmt man zusammen, die Zuverlässigkeit der Workflows zur Verfügung, der einfache Zugriff auf das Strahlrohr (Benutzer selbst planen, unter Verwendung eines Kalenders [siehe oben]) und der voll automatisierten Ansatz von massiv-1 bietet einen strengen, hohem Durchsatz und zeitsparende Alternative zu klassischen MX experimentieren und das Potenzial, fortgeschrittene Verfahren und Anwendungen in die automatischen Abläufe zu implementieren. In naher Zukunft wird Kristall Kartographie in 3D19 implementiert werden, um die Genauigkeit der Röntgen-Zentrierung, während komplexere Protokolle wie Kristall Dehydrierung Experimente20, automatisiert werden. Es ist zu hoffen, dass völlig autonom Datenerhebung eine Standardmethode in MX, klein-Molekül Fragment Bildschirme, qualitativ hochwertige Daten zur Optimierung der Vorführung einer großen Anzahl von schlecht Interferenzgitters Kristalle und automatisch die Phase werden Informationen zu Crystal Strukturen de Novo zu lösen. In Kombination mit den Entwicklungen in der automatisierten Ernte von Kristallen21könnte die Möglichkeit der Proteinlösung Kristall-Struktur als einen automatisierten Service nun Wirklichkeit geworden.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der ESRF für Strahlzeit.
Materials
| Beamline MASSIF-1 | ESRF | ||
| BL21DE3 | New England Biolabs | C2527I | |
| chloramphenicol | Roth | 3886.1 | |
| Concentrators: Amicon Ultra-4 Ultracel -30K | Merck Millipore | UFC803024 | |
| Dialyzing membrane | Spectrumlabs | 132655 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dnase | Roche | 11284932001 | |
| DTT | Euromedex | EU0006-B | |
| EDTA- free protease inhibitors | Roche | 4,693,159,001 | |
| glycerol | VWR Chemicals Prolabo | 14388.29T | |
| His-trap HP | GE healthcare | 17-5247-01 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56750-500G | |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B | |
| LB medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| lipoic acid | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| loop | Hampton Research | HR8-124 | |
| lysozyme | Roche | 10 837 059 001 | |
| MonoQ 5/50 GL | GE healthcare | 17-5166-01 | |
| NaCl | Fisher Chemical | S/3160/60 | |
| Sonicator vibra cell 75/15 | SONICS | ||
| SPINE pucks | MiTeGen | SKU: M-CSM003-0001A | |
| Tris base | Euromedex | 26-128-3094-B | |
| Sodium Formate | Sigma-Aldrich | 1064430500 | |
| GCSH purification buffer | 20 mM TRIS pH 8, 200 mM NaCl | ||
| GCSH cryo-protection buffer | 0.25 M Sodium Formate pH 4, 30% glycerol | ||
| Programs: | |||
| MxCube | Gabadinho, J. et al. MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17 (5), 700-707, doi: 10.1107/S0909049510020005 (2010) | local development | |
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