साइट-निर्देशित Mutagenesis इन विट्रो में और Vivo प्रयोगों उदाहरण में आरएनए बातचीत के साथ ई कोलाई
Summary
साइट निर्देशित mutagenesis एक तकनीक को deoxyribonucleic एसिड (डीएनए) में विशिष्ट उत्परिवर्तनों परिचय प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे साइट करने के लिए-एक 2 कदम और 3 कदम पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) आधारित दृष्टिकोण है, जो ब्याज की किसी भी डीएनए टुकड़ा करने के लिए लागू है के साथ mutagenesis का निर्देशन किया ।
Abstract
साइट निर्देशित mutagenesis एक तकनीक के डीएनए में विशिष्ट उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए छोटे गैर कोडिंग ribonucleic एसिड (sRNA) अणुओं और लक्ष्य दूत RNAs (mRNAs) के बीच बातचीत की जांच का इस्तेमाल किया है । इसके अलावा, साइट निर्देशित mutagenesis आरएनए के लिए विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों को मैप करने के लिए प्रयोग किया जाता है । उत्परिवर्तनों के एक 2 कदम और 3 कदम पीसीआर आधारित परिचय वर्णित है । यह दृष्टिकोण सभी प्रोटीन-आरएनए और आरएनए-आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए प्रासंगिक है । संक्षेप में, तकनीक वांछित उत्परिवर्तन (ओं) के साथ प्राइमर डिजाइनिंग पर निर्भर करता है, और पीसीआर के 2 या 3 कदम के माध्यम से उत्परिवर्तन के साथ एक पीसीआर उत्पाद synthesizing । इसके बाद क्लोनिंग के लिए पीसीआर प्रोडक्ट का इस्तेमाल किया जाता है । यहां, हम वर्णन कैसे साइट प्रदर्शन करने के लिए दोनों 2 और 3 कदम दृष्टिकोण को sRNA, McaS, और mRNA, csgD, आरएनए-आरएनए और आरएनए-प्रोटीन बातचीत की जांच करने के लिए उत्परिवर्तनों परिचय के साथ mutagenesis का निर्देशन किया । हम आरएनए बातचीत की जांच करने के लिए इस तकनीक लागू; हालांकि, तकनीक सभी mutagenesis अध्ययन करने के लिए लागू है (जैसे, डीएनए प्रोटीन बातचीत, एमिनो एसिड प्रतिस्थापन// यह गैर प्राकृतिक ठिकानों के अलावा उत्परिवर्तन के किसी भी प्रकार का परिचय संभव है, लेकिन तकनीक केवल लागू है अगर एक पीसीआर उत्पाद बहाव आवेदन (जैसे, क्लोनिंग और आगे पीसीआर के लिए टेंपलेट) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Introduction
डीएनए अक्सर सेल के सभी संरचनाओं इसके डीएनए के अनुक्रम में इनकोडिंग रहे हैं के बाद से एक जीवित कोशिका के खाका के रूप में जाना जाता है । सटीक प्रतिकृति और डीएनए मरंमत तंत्र सुनिश्चित करें कि उत्परिवर्तनों के केवल बहुत कम दर हो, जो कोडित जीन के सही कार्यों को बनाए रखने के लिए आवश्यक है । डीएनए अनुक्रम के परिवर्तन डीएनए (प्रतिलेखन कारकों और प्रतिबंध एंजाइमों द्वारा मांयता) के साथ शुरू विभिन्न स्तरों पर क्रमिक कार्यों को प्रभावित कर सकते हैं, तो आरएनए (आधार जोड़ी complementarity और माध्यमिक संरचना परिवर्तन) और/या प्रोटीन (अमीनो एसिड प्रतिस्थापन, विलोपन, परिवर्धन या फ्रेम-पाली) । जबकि कई उत्परिवर्तनों जीन समारोह काफी प्रभावित नहीं है, डीएनए में कुछ उत्परिवर्तनों भारी निहितार्थ हो सकते हैं । इस प्रकार, साइट निर्देशित mutagenesis सभी स्तरों पर विशिष्ट डीएनए साइटों के महत्व का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है ।
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक लक्षित mutagenesis विशिष्ट उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण । प्रोटोकॉल दो अलग पीसीआर रणनीतियों पर निर्भर करता है: एक 2 कदम या एक 3-कदम पीसीआर । 2-कदम पीसीआर अगर वांछित उत्परिवर्तन के करीब है या तो 5 ‘ अंत या ब्याज के डीएनए के 3 ‘ अंत (< 200 आधार जोड़े (बीपी) के अंत से) और 3 कदम पीसीआर सभी मामलों में लागू है ।
2-कदम पीसीआर दृष्टिकोण में, 3 प्राइमरों डिजाइन किए हैं, जिसमें प्राइमरों के एक सेट के लिए ब्याज (प्राइमरों 1 और 3, आगे और रिवर्स, क्रमशः) के डीएनए बढ़ाना डिज़ाइन किया गया है, और एक ही किताब उत्परिवर्तन शामिल बनाया गया है । इस उत्परिवर्तन शुरू प्राइमर (प्राइमर 2) एक रिवर्स अभिविंयास अगर उत्परिवर्तन है 5 ‘ अंत और एक आगे अभिविंयास के करीब है अगर उत्परिवर्तन ‘ 3 अंत के करीब है चाहिए । पहली पीसीआर चरण में, प्राइमर 1 + 2 या 2 + 3 क्रमशः 5 ‘ अंत या 3 ‘ अंत करने के लिए करीब एक छोटा सा टुकड़ा को परिलक्षित करता है । परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पाद तो प्राइमर 1 या 3 के साथ कदम दो में एक किताब के रूप में प्रयोग किया जाता है, इस प्रकार ब्याज के डीएनए में उत्परिवर्तन के साथ एक पीसीआर उत्पाद में जिसके परिणामस्वरूप (आंकड़ा 1a) ।
3-चरण पीसीआर में 4 प्राइमरों डिजाइन किए हैं, जिसमें प्राइमरों के एक सेट के लिए ब्याज (प्राइमरों 1 और 4, आगे और रिवर्स, क्रमशः) के डीएनए बढ़ाना डिज़ाइन किया गया है और प्राइमरों का एक सेट अतिव्यापी complementarity के साथ विशिष्ट उत्परिवर्तनों को शामिल करने के लिए डिज़ाइन किया गया है (प्राइमरों 2 और 3, रिवर्स और आगे, क्रमशः) । चरण में एक और दो, प्राइमरों 1 + 2 और 3 + 4 बढ़ाना 5 ‘ और 3 ‘ अंत । चरण तीन में, परिणामस्वरूप पीसीआर उत्पादों से कदम एक और दो के रूप में उपयोग किया जाता है टेंपलेट्स और प्राइमरों के साथ प्रवर्धित 1 + 4 । इस प्रकार, परिणामी पीसीआर उत्पाद वांछित उत्परिवर्तन (आंकड़ा 1b) के साथ ब्याज की डीएनए है ।
जबकि रूपांतरित डीएनए किसी भी बहाव आवेदन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे फिर से एक क्लोनिंग वेक्टर में डीएनए गठबंधन । क्लोनिंग वैक्टर के उपयोग के कई फायदे है जैसे क्लोनिंग और विशिष्ट प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों की सुविधाओं के आधार पर सदिश की आसानी के रूप में । इस सुविधा को अक्सर आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए प्रयोग किया जाता है । आरएनए इंटरेक्शन स्टडीज के लिए एक और तकनीक एक और आरएनए1,2 या प्रोटीन3,4के साथ परिसर में आरएनए की संरचनात्मक जांच है । हालांकि, संरचनात्मक जांच केवल इन विट्रो में किया जाता है, जबकि साइट-निर्देशित mutagenesis और बाद में क्लोनिंग vivo में बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं ।
साइट निर्देशित mutagenesis बड़े पैमाने पर यहां प्रस्तुत के रूप में आरएनए संपर्क अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, 2-या 3-चरणीय पीसीआर के संबंध में प्रमुख विधि डीएनए के किसी भी टुकड़े पर लागू होती है, और इस प्रकार केवल आरएनए-इंटरैक्शन अध्ययनों तक ही सीमित नहीं है ।
उदाहरण देना करने के लिए तकनीक और इसके संभव का उपयोग करता है, के लिए महत्वपूर्ण क्षेत्रों के लक्षण वर्णन के बाद transcriptional विनियमन के mRNA, csgD, के ई कोलाई (ई. कोलाई) किया जाता है । ई. कोलाई में, csgD एक प्रोटीन के साथ सहयोग में छोटे गैर कोडिंग आरएनए, McaS, द्वारा लक्षित है, Hfq, csgD2,4,5के प्रोटीन दमन करने के लिए । तकनीक csgD और McaS के बीच आधार बाँधना क्षेत्र के लिए उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और csgDके Hfq बंधन साइट के लिए । प्राप्त डीएनए तो एक वेक्टर में बाद में प्रयोगों के लिए उपयुक्त क्लोन है । तकनीक के बहाव अनुप्रयोगों में vivo और इन विट्रो प्रयोगों में दोनों शामिल हैं । उदाहरण के लिए, एक पश्चिमी दाग परख और 2 उदाहरण का उपयोग कर vivo में विशेषता है एक electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA) का उपयोग कर इन विट्रो में विशेषता है । दोनों ही मामलों में, यह कैसे साइट निर्देशित mutagenesis अंय तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए ब्याज की एक जीन के बारे में जैविक निष्कर्ष सचित्र है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
साइट निर्देशित mutagenesis विभिंन अनुप्रयोगों की एक व्यापक सरणी है, और यहां, एक vivo में और एक विट्रो प्रयोग में से प्रतिनिधि परिणाम कैसे जैविक तकनीक का उपयोग कर निष्कर्ष बनाने के लिए के उदाहरण के रूप में शामिल थ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक दक्षिणी डेनमार्क ओपन एक्सेस पॉलिसी अनुदान के विश्वविद्यालय को धंयवाद देना चाहूंगा ।
Materials
| Anti-GroEL antibody produced in rabbit | Merck | G6532 | Primary antibody |
| Azure c200 | Azure | NA | Gel imaging workstation |
| Custom DNA oligo | Merck | VC00021 | |
| DeNovix DS-11 | DeNovix | NA | Spectrophotometer for nucleic acid measurements |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Scientific | R0611 | |
| Ethidium bromide solution 1 % | Carl Roth | 2218.1 | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | Thermo Scientific | K0691 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | Fermentas | SM0333 | |
| Gerard GeBAflex-tube Midi | Gerard Biotech | TO12 | Dialysis tubes for electro elution |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704406 | Horizontal electrophoresis system |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Merck | F3165 | Primary antibody |
| Mouse Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0447 | HRP conjucated secondary antibody |
| NucleoSpin miRNA | Macherey Nagel | 740971 | RNA purification |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Scientific | NP0323BOX | Bis-Tris gels for protein separation |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs | M0531S | DNA polymerase |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Rabbit Immunoglobulins | Dako Cytomation | P0448 | HRP conjucated secondary antibody |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| SigmaPlot | Systat Software Inc | NA | Graph and data analysis software tool |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | PCR machine |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | Ligase |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| TAE Buffer (Tris-acetate-EDTA) (50X) | Thermo Scientific | B49 |
Referências
- Bouvier, M., et al. Small RNA binding to 5′ mRNA coding region inhibits translational initiation. Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).
- Jorgensen, M. G., et al. Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Antal, M., et al. A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).
- Andreassen, P. R., et al. sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA. Nucleic Acids Research. , (2018).
- Thomason, M. K., et al. A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli. Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- . JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). Journal of Visualized Experiments. , (2018).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).
- Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
- Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites. Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
