هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للإعداد التجريبية لإجراء تحليل لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.
الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية لديها إمكانات هائلة كعلاج التجديدي لمختلف الأمراض التنكسية. الحمض النووي هو مستودع البيانات الوراثية في كافة الخلايا، بما في ذلك الخلايا الجذعية، وسلامتها أمر أساسي لقدرتها على التجدد. الخلايا الجذعية البالغة الخضوع للنشر السريع في مختبرات لتحقيق الأرقام اللازمة للزرع. نمو الخلايا السريع يؤدي إلى فقدان سلامة الحمض النووي والايضات المتراكمة، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل alkylating وكلاء. زرع هذه الخلايا سيسفر engraftment الفقيرة وتجديد الجهاز المتدهورة. وعلاوة على ذلك، زرع الخلايا التالفة الحمض النووي يؤدي إلى طفرات، عدم الاستقرار الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وربما تهدد الحياة من الأمراض مثل السرطان. ولذلك، هناك حاجة ملحة لأسلوب مراقبة الجودة لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء. هنا، نحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتقييم سلامة الحمض النووي للخلايا الجذعية قبل زرع الخلايا.
وتبين الأدلة التجريبية والسريرية أن زرع الخلايا يمكن معتدلة لتحسين أداء البطين الأيسر الهوس من فشله في قلوب1،2،،من34،5 ،،من67،،من89. التطورات الأخيرة قد فتحت زيادة جاذبية الفرص لإنعاش القلب والأوعية الدموية؛ وتشمل هذه التعبير القسري من عوامل إعادة برمجة خلايا جسدية للحث على بلوريبوتينسي وتفرق هذه الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (التوجيهية) في الأنساب القلب مختلفة، ومن المهم كارديوميوسيتي (سم)10، 11 , 12 , 13-المواد الوراثية في كل خلية، بما في ذلك إيبسكس الذي تم إنشاؤه اصطناعياً والمستمدة من اللجنة التوجيهية سم (iPS-سم)، هو الحمض النووي. ويملي التعليمات الوراثية المخزنة في الحمض النووي النمو والتنمية، ووظيفة الخلايا والأنسجة، وأجهزة، والكائنات الحية. الحمض النووي ليست خاملة؛ خلية الأيض، مثل الأكسجين التفاعلية والكربونيل، والأنواع النيتروجين، و alkylating وكلاء يمكن أن الحمض النووي يسبب الضرر في المختبر والمجراه في14،15،،من1617. الأهم من ذلك، يحدث تلف الحمض النووي بداهة في كل خلية، بتواتر كبير. إذا لم يتم تصحيح هذه الأضرار، فإنه سيؤدي إلى طفرة الحمض النووي، والشيخوخة الخلوية، وفقدان سلامة الحمض النووي، والخلية، وربما، من الأمراض، بما في ذلك السرطان تهدد الحياة. لذلك، الإبقاء على سلامة الحمض النووي ضروري لأي خلية، وبخاصة إيبسكس، التي تتمتع بإمكانات هائلة في العيادة.
لتقييم كمية والسلامة لعزل الحمض النووي، تتوفر معدات باهظة الثمن في السوق. ومع ذلك، هناك أية أساليب بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم سلامة الحمض النووي في الخلايا دون عزل الخلايا. وعلاوة على ذلك، تدهور الحمض النووي الناجم عن المستخدم أثناء عزل الحمض النووي أحد العوائق الرئيسية في استخدام هذه الأساليب. هلام خلية واحدة التفريد (المعروفة بمقايسة المذنب)18،19 و γH2A.X إيمونولابيلينج8 التقنيات هي النهج الأساسية في مختبرات البحوث لتقييم الأضرار في الحمض النووي. هذان الأسلوبان لا تتطلب معدات باهظة الثمن أو عزل الحمض النووي لتحليل الحمض النووي سلامة8،،من2021. منذ ذلك الحين، تم إجراء هذه التقنيات مع خلايا كاملة؛ الحمض النووي/رنا/البروتين تدهور المستحثة بالمستخدم أثناء إعداد عينة لن يؤثر على هذه البروتوكولات. هنا، لتقييم أضرار الحمض النووي والحمض النووي الضرر ردا في الساق والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية، ونحن نقدم البروتوكولات خطوة بخطوة لتنفيذ كلا المذنب المقايسة و γH2A.X إيمونولابيلينج. وعلاوة على ذلك، الجمع بين هذين النهجين، نقترح إجراء تقييم السذاجة التي يمكن استخدامها لتقييم مدى ملاءمتها للخلية لزرع الأعضاء.
مقايسة المذنب، أو خلية واحدة جل التفريد، تدابير فواصل الحمض النووي في الخلايا. يتم تفكيك الخلايا المضمنة في [اغروس] انصهار منخفضة بشكل نوكليويدس التي تحتوي على الحمض النووي سوبيركويليد. عند التفريد، ترحيل قطع صغيرة من الحمض النووي مجزأة وقطع خيوط الحمض النووي عن طريق المسام [اغروس]، حين دنا سليمة، بسبب حجمها الهائل بالاقتران مع البروتين المصفوفة، سيكون هجرة مقيدة. يحاكي نمط الحمض النووي الملون تحت مجهر fluorescence مذنب. رأس المذنب يحتوي على الحمض النووي سليمة وهو يتألف من أجزاء الذيل وكسر خيوط الحمض النووي. ويمكن قياس جزء صغير أضرار الحمض النووي بشدة الأسفار من تلف الحمض النووي (ذيل المذنب) بالنسبة إلى كثافة الحمض النووي (رأس المذنب) سليمة. يمكن حساب هذه اللحظة ذيل معلمة كما هو مبين في الشكل 1.
أضرار الحمض النووي يؤدي إلى الفسفرة هستون H2A. X (γH2A.X) في Ser139 التي مؤنزم ATM و ATR الحمض النووي-PK. الفسفرة وتجنيد H2A. X في فواصل حبلا الحمض النووي يسمى استجابة تلف الحمض النووي (DDR) ويحدث سريعاً بعد أن تلف الحمض النووي. وفي أعقاب هذه العملية، والقبض على نقطة تفتيش بوساطة دورة الخلية والحمض النووي هي بدأت عمليات إصلاح. بعد الانتهاء الناجح لإصلاح الحمض النووي، ديفوسفوريلاتيد γH2A.X وإبطال من فوسفاتاسيس. لفترات طويلة ومتعددة فواصل حبلا الحمض النووي يؤدي إلى تراكم البؤر γH2A.X في الحمض النووي. وهذا يشير إلى عدم التمكن من إصلاح أضرار الحمض النووي وسلامة الحمض النووي للخلية. يمكن تحديد هذه البؤر γH2A.X في الحمض النووي، ويمكن حساب عدد البؤر التسريح وإعادة الإدماج باستخدام البروتوكول في الباب 2.
سلامة الحمض النووي يصور سلامة الخلية. الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي تضررت كثيرا في الإجهاد وتفقد سلامتها في نهاية المطاف. سلامة الجذعية والخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية التي تنتشر غرض الزرع الرئيسي للخلايا لأداء وظيفتها المطلوبة. زرع خلايا بتلف الحمض النووي سيؤدي في معدل انجراف…
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل وأيده في الجزء الوطني للقلب والرئة والدم المعهد المنح RO1-HL-99507, HL-114120، HL-131017، HL138023، و UO1-HL-134764 (على تشانغ جيه)، و “جمعية القلب الأمريكية العلمية التنمية منحة” 17SDG33670677 (إلى ر. كانابان).
0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
RPMI | Gibco | 11875-093 | |
SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |