Измерение на форму и размер частиц ила, иммобилизованных в Агаре с открытым исходным кодом программного конвейера
Summary
Размер и форма частиц ила являются важными параметрами, которые измеряются с помощью различных методов. Неточности возникают от нерепрезентативная выборка, субоптимальный изображения и параметры субъективного анализа. Чтобы свести к минимуму эти ошибки и облегчения измерения, мы представляем протокол, указав каждый шаг, в том числе открытым исходным кодом программного конвейера.
Abstract
Экспериментальная биореакторов, например те обработки сточных вод, содержат частицы, размер и форма которого являются важными параметрами. Например размер и форму хлопьев ила может указывать условия в микромасштабные, а также непосредственно влияют на насколько хорошо Ил оседает в отстойник.
Размер частиц и формы являются оба измерения, ошибочно «простой». Многие тонкие вопросы, зачастую нерешенными в неофициальных протоколов, могут возникнуть, когда выборки, обработки изображений и анализа частиц. Методы выборки может быть искажена или не обеспечивают достаточно статистической мощности. Образцы, сами могут быть плохо сохранились или претерпевают изменения во время иммобилизации. Изображения не может быть достаточно высокого качества; перекрывающиеся частицы, глубина резкости, масштаб и различных шума можно все производят плохие результаты. Плохо указанного анализа можно ввести предвзятости, например, производимый вручную изображения ограничивание и сегментации.
Доступность и производительность желательно вместе с воспроизводимостью. Метод доступным, высокая пропускная способность может позволить более частое измерение частиц, производить много изображений, содержащих тысячи частиц. Метод, который использует недорогие реактивы, общие рассечения микроскопа и свободно доступных открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа позволяет повторяемые, доступной, воспроизводимые и частично автоматизированных экспериментальные результаты. Кроме того продукт такого метода может быть хорошо отформатированный, четкие и легко понять, программное обеспечение для анализа данных, облегчения анализов в лаборатории и обмена данными между лабораториями.
Мы представляем протокол, который подробно описаны шаги, необходимые для производства такой продукции, включая: отбор проб, образец подготовки и иммобилизации в агар, приобретения цифровых изображений, анализ цифровых изображений и примеры конкретного эксперимента рисунок поколения от результаты анализа. Мы также включили конвейера анализа данных открытым исходным кодом поддерживают этот протокол.
Introduction
Этот метод предназначен для предоставления четко, повторяемые и частично автоматизированный метод для определения размера и формы распределения частиц в биореакторах, особенно те, которые содержат ила хлопьев и аэробных гранул1 , 2. обоснование этого метода были для повышения доступности, простоты, пропускная способность, и повторяемость наших существующих собственных протоколов3,4, облегчения измерения частиц для других и содействовать обмену и Сравнение данных.
Существует две широкие категории анализа измерения частиц – прямой визуализации и логически выведенная методы, с помощью таких качеств, как рассеяние света5. Хотя логически выведенная методы могут быть автоматизированы и имеют большой пропускной способности, оборудование стоит дорого. Кроме того хотя логически выведенная методы можно точно определить эквивалентный размер частиц6, они не дают подробную форму информации7.
Из-за необходимости данных фигуры на прямых изображений основе наш метод. Хотя существуют некоторые методы визуализации высокой пропускной способности, они традиционно требовали дорогостоящих коммерческих аппаратных или пользовательские построен решения8,9. Использовать общие, доступного аппаратного и программного обеспечения, что, хотя страдает от снижения пропускной способности, производит гораздо больше изображений частиц, чем минимально необходимой для многих анализов10был разработан наш метод.
Существующие протоколы, может не указывать важные выборки и изображения приобретение шаги. Другие протоколы могут указать вручную, которые вводят субъективные уклоном (такие как ad hoc Бинаризация11). Четко определенный метод, определяющий выборки, иммобилизации и изображения приобретение шаги, в сочетании с свободно доступных анализ программного обеспечения позволит повысить в лаборатории анализа изображений и сравнение между лабораториями. Основная цель настоящего Протокола заключается в рабочий процесс и инструменты, которые должны привести к воспроизводимость результатов от различных лабораторий для того же образца.
Отдельно от нормализации процесса анализа изображения, данные, подготовленные этот трубопровод записывается в четко определенных, хорошо отформатированный файл12 , пригодные для использования популярных данных анализа пакетов13,14, ослабление эксперимент конкретные анализы (например, пользовательские рисунок поколения) и облегчения обмена данными между лабораториями.
Этот протокол особенно предлагается для исследователей, которые требуют данные фигуры частиц, не имеют доступа к логически выведенная методы, не хотите, чтобы развивать свои собственные изображения анализа трубопровода и хотели бы поделиться своими данными легко с другими
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя системы анализа изображений достаточно надежными и КК шаги для обеспечения бедных изображения удаляются, надлежащее внимание конкретным вопросам в выборки, пластины подготовки и загрузки изображений может повысить точность данных и доли изображения, передавая КК.
<p class="jove_content…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от национального фонда науки CBET 1336544.
Фиджи, R и Python логотипы используются в соответствии с следующую политику товарного знака:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , согласно лицензии CC-BY-SA 4.0, перечисленные в: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Фиджи: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
Referências
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004)
- . Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012)
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- van Rossum, G. . Python tutorial. , (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018)
- Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. . seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016)
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ (2009)
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
