Måle formen og størrelsen på aktivslam partikler immobilisert i Agar med en åpen kildekode programvare rørledning
Summary
Størrelsen og form av partikler i aktivert slam er viktige parametere som måles ved hjelp av ulike metoder. Feil oppstår fra ikke-representative utvalg, suboptimal bilder og subjektive analyser parametere. For å minimere disse feilene og lette måling, presenterer vi en protokoll angir hvert trinn, inkludert en åpen kildekode programvare rørledning.
Abstract
Eksperimentell bioreaktorer, som de behandler avløpsvannet, inneholde partikler som størrelse og form er viktige parametere. For eksempel kan størrelsen og formen på aktivslam flocs angi forholdene på Mikroskala, og også direkte påvirke hvor godt slam bosetter seg i en clarifier.
Partikkelstørrelse og form er begge villedende “enkel” mål. Mange subtile problemer, ofte uadressert i uformelle protokoller kan oppstå når prøvetaking imaging og analyserer partikler. Prøvetaking metoder kan være partisk eller gir ikke nok statistisk styrke. Prøvene seg kan være dårlig bevart eller gjennomgå endring under immobilisering. Bilder kan ikke være av tilstrekkelig kvalitet; overlappende partikler, kan dybdeskarphet, forstørrelsesnivå, og ulike støy alle gi dårlige resultater. Dårlig angitte analyse kan introdusere bias, som produseres av manuell bilde terskelverdi og segmentering.
Rimelig og gjennomstrømning er ønskelig sammen med reproduserbarhet. En rimelig, høy gjennomstrømming metode kan aktivere hyppigere partikkel måling, produsere mange bilder som inneholder tusenvis av partikler. En metode som bruker billig reagenser, felles dissecting mikroskop og fritt tilgjengelige åpen kildekode analyseprogramvare kan gjentas, tilgjengelig, reproduserbare og delvis automatisert eksperimentelle resultater. Videre, produktet av slik metode kan være velutformet, veldefinerte og lett forstått av dataanalyse programvare, lettelser både innen-lab analyser og datadeling mellom laboratorier.
Vi presenterer en protokoll som viser trinnene som trengs for å produsere et produkt, inkludert: prøvetaking, prøve forberedelse og immobiliseringsløsninger agar, digital image vinningen, digital bildeanalyse og eksempler på eksperimentet-spesifikk figur generasjon fra den analyseresultater. Vi har også inkludert en åpen kilde data analyse rørledning for å støtte denne protokollen.
Introduction
Formålet med denne metoden er en godt definert, repeterbare og delvis automatisert metode for å bestemme størrelsen og formen distribusjoner av partikler i bioreactors, spesielt de som inneholder aktivslam flocs og aerobic granulater1 , 2. begrunnelsen bak denne metoden var å forbedre den rimelig, enkelhet, gjennomstrømning, og repeterbarhet våre eksisterende in-house protokoller3,4, lette partikkel måling for andre, og lette deling og sammenligning av data.
Det er to hovedkategorier av partikkel måling analyse – direkte tenkelig og inferential metoder å bruke slike egenskaper som lysspredning5. Selv om inferential metoder kan automatiseres og har stor gjennomstrømming, er utstyret dyrt. Dessuten, mens inferential metoder å nøyaktig bestemme tilsvarende størrelsen på en partikkel6, gir de ikke detaljert form information7.
Behovet for figurdata, har vi basert vår metode på direkte bildebehandling. Mens noen høy gjennomstrømming tenkelig metoder finnes, har de tradisjonelt nødvendige dyr kommersiell maskinvare eller tilpassede innebygde løsninger8,9. Vår metode er blitt bebygget for å ansette felles, rimelig maskinvare og programvare som, selv om lider av en reduksjon i gjennomstrømning, gir langt mer partikkel bilder enn minimum nødvendig for mange analyser10.
Eksisterende protokoller kan ikke angi viktig prøvetaking og bilde oppkjøpet trinnene. Andre protokoller kan angi manuelle trinn som innføre subjektive bias (for eksempel ad hoc terskelverdi11). En veldefinert metode som angir prøvetaking immobilisering trinnene, og bilde oppkjøpet kombinert med fritt tilgjengelig analyseprogramvare vil forbedre både innen-lab bildeanalyse og sammenligninger mellom laboratorier. Et hovedmål for denne protokollen er å gi en arbeidsflyt og verktøy som skal føre til reproduserbar resultater fra ulike labs for samme prøven.
Bortsett fra normalisere bildet analyseprosessen, er data produsert av denne rørledningen registrert i en veldefinert og godt formatert fil12 egnet for bruk av populære data analyse pakker13,14, lettelser eksperiment konkrete analyser (som egendefinert figur generasjon) og går lettere datadeling mellom laboratorier.
Denne protokollen er spesielt foreslått for forskere som krever partikkel figurdata, har ikke tilgang til inferential metoder, ikke ønsker å utvikle sine egne bildet analyse rørledning, og ønsker å dele sine data enkelt med andre
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om bildet analyse systemet er ganske robust og QC skritt er tatt for å sikre dårlig bilder er fjernet, kan riktig oppmerksomhet til problemer i prøvetaking, plate forberedelser og bildeopptak forbedre både nøyaktigheten av dataene og andelen av bilder passerer QC.
Prøvetaking konsentrasjon
Antar et representativt utvalg overtatt, er viktigste å sikre at tilstrekkelig partikler tilstede for representant9 og effektiv analyse mens ikke så k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Science Foundation CBET 1336544.
FIJI, R og Python logoer brukes med den i samsvar med følgende varemerke retningslinjer:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , som CC-BY-SA 4.0 lisens oppført på: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
Referências
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004)
- . Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012)
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- van Rossum, G. . Python tutorial. , (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018)
- Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. . seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016)
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ (2009)
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
