Rat placental doğal katil hücre Cytolytic fonksiyon değerlendirilmesi için bir plaka tabanlı sitotoksisite assay
Summary
Burada, doğal katil hücrelerin sitotoksisik fonksiyonunu renkmetrik plaka tahlili ile plasenta satıyor ‘dan izole etmek ve değerlendirmek için ayrıntılı bir metodoloji sağlıyoruz. Plasental iskemi azaltılmış uterus perfüzyon basınç sıçan modeli antikor aracılı yalıtım ve doğal katil hücrelerin sitotokleş fonksiyonunun değerlendirilmesi göstermek için seçildi.
Abstract
Bu desidual doğal katil (NK) hücrelerin kurulması ve normal gebelik bakım kritik bir rol oynarlar bilinmektedir. Son çalışmalar, tekrarlayan düşük ve preeklampsi gibi olumsuz gebelik komplikasyonlarından muzdarip kadınlarda dolaşan ve desidual NK hücrelerinin değiştirilmiş bir nüfusunu göstermiştir. Grubumuzun çalışmaları, gebelikte hipertansiyon, yüzey aktivasyon işaretçileri ifadesine dayalı plasenta aktif NK hücrelerinin artan bir nüfus ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Bu makalede, cerrahi olarak indüklenen plasental iskemi preeklampsi benzeri bir hayvan modelinde plasenta satıyor izole NK hücrelerinin sitotokezik fonksiyonunu değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmaktadır. Aşağıdaki adımlar ayrıntılı olarak açıklanmıştır: tek hücreli süspansiyon üretimi, NK hücre yalıtımı, ex vivo stimülasyon, effector: hedef hücre Co-Culture, ve sitotoksisite tahlil.
Introduction
Preeklampsi fetal büyüme kısıtlaması, son organ hasarı ve kronik bağışıklık aktivasyonu ile karakterize gebelik hipertansif bir hastalıktır. Preeklampsi olan kadınlarda kronik bağışıklık aktivasyonu artan dolaşım ve plasental inflamatuar sitokinlerin yol açar, CD4+ T hücreleri nüfus bir dengesizlik, ve aktif doğal katıl (NK) hücrelerin artan bir nüfus1. Laboratuvarımız tarafından son yayınlanan çalışmalar, preeklampsi azaltılmış uterin perfüzyon basıncı (RUPP) sıçan modelinde preeklampsi ile ilişkili bazı Patofizyoloji neden olan NK hücreleri için bir rol gösteriyor. NK hücrelerinde harekete geçirmek işaretçilerinin yüzey ifadesini ölçmek için Akış sitometrisi kullanarak, normal hamile (NP) farelerine kıyasla Rupp farelerinin dolaşım ve plasenta satıyor aktif NK hücrelerinin artan bir nüfus görüldü2.
Akış sitometri gözlemlerini onaylamak için, NP ve Rupp fareler plasenta satıyor izole NK hücrelerinin sitotokezik aktivitesini değerlendirmek için fonksiyonel çalışmalar yapıldı. Sitotoksisik CD8+ T HÜCRELERININ ve NK hücrelerinin sitotokezik fonksiyonunun değerlendirilmesi için çeşitli yöntemler mevcuttur. Fonksiyonel sitotoksisik analiz için altın standardı krom salınım tahlil3. Kullanılan diğer gelişmiş protokoller arasında akış sitometri4, görüntü sitometri5, calcein sürüm6ve en son biyolüminesans7yer aldı. Bu video, ticari olarak kullanılabilen bir LDH sitotoksisite assay kiti kullanılarak NK hücrelerinin sitotoksisik fonksiyonunu ölçmek için iyi kurulan lakdamak dehidrojenaz (LDH) serbest bırakma tahlil kullanarak ayrıntılı bir protokol sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
En iyi sonuçlar için dikkate alınması gereken önemli notlar bir dizi vardır. Kullanılan hücrelerin sterilitesi çok önemlidir. Plasentanın toplanması sonrasında, NK hücrelerinin hazırlanması ve yalıtımının Biyogüvenlik kabininde steril koşullarda gerçekleştirilmesi önemlidir. Ayrıca, hücresel hasar üzerine tüm hücreler LDH serbest olduğundan, yalıtım sonra ve Co-Culture sürecinde NK hücrelerinin yüksek bir canlılığı elde etmek için bakım alınmalıdır. NK hücrelerinden çok fazl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal kalp akciğer ve kan Enstitüsü Sağlık Ulusal Enstitüleri tarafından Grant R00HL130456, Ulusal Sağlık Enstitüsü Genel Tıp Bilimleri Ulusal sağlığı Enstitüleri tarafından ödül P20GM104357 altında, ve tarafından desteklenmektedir Mississippi ıNBRE, bir kurumsal Kalkınma Ödülü tarafından finanse (fikir) genel Tıp Bilimleri Ulusal Enstitüsü Sağlık Ulusal Enstitüleri hibe numarası P20GM103476 altında. İçerik sadece yazarlar sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
