En Plate-baserad Cytotoxicitetsanalys för bedömning av råtta Placental Natural Killer cell Cytolytic funktion
Summary
Här ger vi en detaljerad metodik för att isolera och bedöma cytotoxisk funktion av naturliga mördar celler från moderkakor av en kolorimetrisk plattanalys. Den reducerade uterin per fusion tryck råtta modell av placenta ischemi valdes för att demonstrera anti kropp-medierad isolering och bedömning av den cytotoxiska funktionen av naturliga mördar celler.
Abstract
Det är väl känt att decidubbla naturliga mördare (NK) celler spelar en avgörande roll för etablering och underhåll av normal graviditet. Nyligen genomförda studier har visat en förändrad population av cirkulerande och decidubbla NK celler hos kvinnor som lider av ogynnsamma graviditetskomplikationer såsom recidiverande missfall och preeclampsi. Studier från vår grupp har visat att hypertoni under graviditeten är förknippad med en ökad population av aktiverade NK-celler i moderkakan baserat på uttrycket av ytan aktiverings markörer. Detta manuskript ger ett detaljerat protokoll för att bedöma den cytotoxiska funktionen av NK celler isolerade från moderkakor i en Preeclampsia-liknande djur modell av kirurgiskt inducerad placenta ischemia. Följande steg beskrivs i detalj: generering av enstaka cell SUS pension, NK cell isolering, ex vivo stimulering, Effector: mål cell co-Culture, och cytotoxicitetsanalysen.
Introduction
Preeclampsi är en Hypertensiv sjukdom av graviditeten kännetecknas av foster tillväxt begränsning, organ skador och kronisk immun aktivering. Kronisk immun aktivering hos kvinnor med preeclampsi leder till ökad cirkulerande och placenta inflammatoriska cytokiner, en obalans i CD4+ T-celler populationer, och en ökad population av aktiverade Natural Killer (nk) celler1. Studier som nyligen publicerats av vårt labb visar en roll för NK celler i att orsaka en del av patofysiologin i samband med havandeskaps förgiftning i minskad uterin per fusion Pressure (Rupp) råtta modell av preeclampsi. Använda flödescytometri för att mäta ytan uttryck för aktiverings markörer på NK-celler, en ökad population av aktiverade NK-celler i cirkulationen och moderkakor av Rupp råttor jämfört med normala gravida (NP) råttor observerades2.
För att bekräfta flödescytometri observationer, funktionella studier för att bedöma den cytotoxiska aktiviteten hos NK-celler isolerade från moderkakor av NP och Rupp råttor utfördes. Det finns flera metoder tillgängliga för bedömning av cytotoxisk funktion av cytotoxiska CD8+ T celler och NK celler. Den gyllene standarden för funktionell cytotoxisk analys är krom release assay3. Andra utvecklade protokoll som används inkluderar flödescytometri4, bildcytometri5, calcein release6, och senast mareld7. Denna video kommer att ge ett detaljerat protokoll om hur du använder den väletablerade laktatdehydrogenas (LDH) Release-test för att mäta cytotoxisk funktion av NK celler med hjälp av en kommersiellt tillgänglig LDH cytotoxicitet assay kit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett antal viktiga viktiga anmärkningar att överväga för optimala resultat. Steriliteten av de celler som används är mycket viktigt. Efter insamlingen av moderkakan är det viktigt att beredning och isolering av NK-cellerna utförs under sterila förhållanden i ett biosäkerhets skåp. Dessutom, eftersom alla celler frigör LDH vid cellulära skador, bör försiktighet iakttas för att erhålla en hög livs kraft för NK-celler efter isolering och under samkulturprocessen. För mycket spontan LDH-frisätt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den nationella hjärt lung-och blod Institutet för de nationella hälso institut under Grant R00HL130456, det nationella institutet för allmänna medicinska vetenskaper av nationella institut för hälsa under tilldelning P20GM104357, och av Mississippi INBRE, finansierat av en institutionell utveckling Award (IDeA) från de nationella instituten för allmänna medicinska vetenskaper av nationella institut för hälsa under bidrag nummer P20GM103476. Innehållet är helt och hållet författarens ansvar och representerar inte nödvändigt vis de officiella åsikterna hos de nationella hälso instituten.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
