En plate-basert cytotoksisitet analysen for vurdering av Rat placenta Natural killer Cell Cytolytisk funksjon
Summary
Her gir vi en detaljert metodikk for å isolere og vurdere cytotoksisk funksjon av naturlige killer celler fra placentas av et fargemetrisk plate analysen. Den reduserte livmor trykk rotte modell av placenta iskemi ble valgt til å demonstrere antistoff-mediert isolasjon og vurdering av cytotoksisk funksjon av naturlige killer celler.
Abstract
Det er velkjent at decidual naturlig Killer (NK) celler spille en avgjørende rolle i etablering og vedlikehold av normal graviditet. Nyere studier har vist en endret befolkning på sirkulerende og decidual NK celler hos kvinner som lider av uønskede graviditet komplikasjoner som tilbakevendende spontanabort og preeclampsia. Studier fra vår gruppe har vist at hypertensjon i svangerskapet er forbundet med en økt befolkning på aktiverte NK celler i morkaken basert på uttrykk for overflaten aktiverings markører. Dette manuskriptet gir en detaljert protokoll for å vurdere cytotoksisk funksjon av NK celler isolert fra placentas i en preeclampsia-lignende dyr modell av kirurgisk indusert placenta iskemi. Følgende trinn er beskrevet i detalj: generering av enkelt celle suspensjon, NK celle isolasjon, ex vivo stimulering, effektor: Target celle co-kultur, og cytotoksisitet analysen.
Introduction
Preeclampsia er en hypertensive forstyrrelse av svangerskapet preget av fosterets vekst restriksjon, end organskade og kronisk immunforsvar. Kronisk uimottakelig aktivering hos kvinner med preeclampsia fører til økt sirkulerende og placenta inflammatorisk cytokiner, en ubalanse i CD4+ T celler populasjoner, og en økt befolkning på aktivert Natural Killer (NK) celler1. Studier nylig publisert av vår Lab demonstrere en rolle for NK celler i forårsaker noen av patofysiologi forbundet med preeclampsia i redusert livmor trykk (RUPP) rotte modell av preeclampsia. Benytter flyte flowcytometri å mål overflate gjengivelsen av aktivisering merker opp på NK celler, en forhøyet befolkning av aktivert NK celler inne sirkulasjonen og placentas av RUPP rotter sammenlignet med normal gravid (NP) rotter var observert2.
For å bekrefte flyten flowcytometri observasjoner, funksjonelle studier for å vurdere cytotoksisk aktivitet av NK celler isolert fra placentas av NP og RUPP rotter ble utført. Det er flere metoder tilgjengelig for vurdering av cytotoksisk funksjon av cytotoksisk CD8+ T celler og NK celler. Gullstandarden for funksjonell cytotoksisk analyse er den krom Release analysen3. Annet bebygget protokoller anvende inkludere flyte flowcytometri4, image flowcytometri5, calcein løslate6, og høyst i den seneste tid bioluminesens7. Denne videoen vil gi en detaljert protokoll om hvordan du bruker veletablerte melkesyre dehydrogenase (LDH) Release analysen for å måle cytotoksisk funksjon av NK celler ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig LDH cytotoksisitet analysen Kit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finnes en rekke viktige viktige notater å vurdere for optimale resultater. Sterilitet av cellene utnyttet er svært viktig. Etter samling av morkaken, er det viktig at utarbeidelse og isolering av NK cellene er utført under sterile forhold i en biosafety kabinett. Videre, fordi alle celler slipper LDH upon Cellular skade, bør forsiktighet tas for å få en høy levedyktighet av NK celler etter isolasjon og under co-kulturen prosessen. For mye spontan LDH utgivelse fra NK cellene kan ofte føre til negative, ubruke…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Heart Lung og Blood Institute of National Institutes of Health under Grant R00HL130456, National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health under prisen P20GM104357, og av Mississippi INBRE, finansiert av en institusjonell Development Award (idé) fra National Institutes of General Medical Sciences i National Institutes of Health under stipend nummer P20GM103476. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
