랫 트 태 반 천연 킬러 세포 세포 용 분해 기능의 평가를 위한 플레이트 기반 세포 독성 분석
Summary
여기, 우리는 분리 하 고에서 자연 킬러 세포의 세포 독성 기능을 평가 하는 상세한 방법론을 제공 합니다. 비 색 판 분석에 의해. 태 반 허 혈의 감소 된 자 궁 관류 압력 쥐 모형은 천연 킬러 세포의 세포 독성 기능의 항 체 매개 분리 및 평가를 입증 하기 위해 선택 되었다.
Abstract
의사는 정상적인 임신의 확립과 유지에 중요 한 역할을 하는 것으로 알려져 있습니다. 최근의 연구에의 하면 재발 성 유산 및 자간 전 증과 같은 임신 합병증을 앓고 있는 여성들의 순환 및 의사 이중 NK 세포의 변화 된 인구가 입증 되었다. 우리 그룹의 연구는 임신 중 고혈압이 표면 활성화 마커의 발현을 기반으로 태 반에 활성화 된 NK 세포의 증가 된 인구와 연관 된다는 것을 보여주었습니다. 이 원고는 수술로 유도 된 태 반 허 혈의 자간 전 증 유사 동물 모델에서와 같이, 장소에서 분리 된 NK 세포의 세포 독성 기능을 평가 하기 위한 상세한 프로토콜을 제공 한다. 다음 단계는 상세히 설명 된다: 단일 세포 현 탁 액의 생성, NK 세포 분리, 전 생체 자극, 이펙터: 표적 세포 공동 배양 및 세포 독성 분석 법.
Introduction
자간 전 증은 태아 성장 제한, 말단 장기 손상 및 만성 면역 활성화를 특징으로 하는 임신의 고혈압 질환 이다. 자간 전 증을 가진 여성에서의 만성 면역 활성화는 증가 된 순환 및 태 반 염증 성 사이토카인, CD4+ T 세포 집단의 불균형 및 활성화 된 천연 킬러 (NK) 세포의 증가 된 인구에 이르게 한다1. 우리 연구실에서 최근에 출판 된 연구는 자간 전 증의 자 궁 내 관류 압력 (파열)을 자간 전 증과 관련 된 일부 병 리 생리학의 원인에서 NK 세포에 대 한 역할을 증명 한다. 유 세포 분석을 이용 하 여 NK 세포에 대 한 활성화 마커의 표면 발현을 측정 하 고, 정상 임신 (NP) 쥐에 비하여 파열 된 랫 트의 순환 및 위치에서 활성화 된 NK 세포의 증가 된 인구가 관찰 되었다2.
유 세포 분석 관찰을 확인 하기 위해, 플 래 트에서 분리 된 NK 세포의 세포 독성 활성을 평가 하는 기능적 연구가 NP 및 파열 쥐의 수행 되었다. CD8+ T 세포 및 NK 세포의 세포 독성 기능에 대 한 평가에 사용할 수 있는 몇 가지 방법이 있다. 기능적 세포 독성 분석을 위한 금 표준은 크롬 방출 검정3이다. 사용 되는 기타 개발 된 프로토콜은 유 세포 분석4, 이미지 분석5, calcein 릴리즈6및 가장 최근의 생물 발광7을 포함 한다. 본 영상은 상업적으로 입수 가능한 LDH 세포 독성 분석 키트를 이용 하 여 잘 확립 된 락 테이 트 탈 수소 효소 (LDH) 방출 분석을 이용 하 여 NK cell의 세포 독성 기능을 측정 하는 자세한 프로토콜을 제공할 것 이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최적의 결과를 위해 고려해 야 할 중요 한 주요 참고 사항이 많이 있습니다. 이용 된 세포의 무 균은 매우 중요 합니다. 태 반의 채취 후, 생물 안전 내각에서 멸 균 조건 하에서 NK 세포의 조제 및 분리가 수행 되는 것이 중요 하다. 더욱이, 모든 세포는 세포 손상 시 LDH를 방출 하기 때문에, 분리 후 및 공동 배양 과정 동안 NK 세포의 높은 생존 능력을 얻기 위해 주의를 기울여야 한다. NK 세포에서 너?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 심장 폐와 보조금 R00HL130456에서 건강의 국립 연구소의 혈액 연구소에 의해 지원 되었다, 국립 의료 과학 연구소의 국가 학회에서 수상 P20GM104357에서, 그리고 미시시피 INBRE는 보조금 번호 P20GM103476 하에서 국립 건강 학회 국립 연구소의 기관 개발 상 (IDeA)에 의해 자금을 지원 했다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이 며, 반드시 건강의 국가 학회 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
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