Un saggio di citotossicità a base di piastre per la valutazione della funzione citolitica della cellula killer naturale del ratto placentare
Summary
Qui, forniamo una metodologia dettagliata per isolare e valutare la funzione citotossica delle cellule killer naturali da placenta da un saggio di placca colorimetrica. La riduzione della pressione di perfusione uterina modello ratto di ischemia placentare è stato scelto per dimostrare l’isolamento mediato da anticorpi e la valutazione della funzione citotossica delle cellule Natural Killer.
Abstract
È ben noto che le cellule decidue Natural Killer (NK) giocano un ruolo critico nella creazione e nel mantenimento della gravidanza normale. Studi recenti hanno dimostrato una popolazione alterata di cellule NK circolanti e decidue nelle donne che soffrono di complicanze avverse di gravidanza come aborto spontaneo e preeclampsia. Studi del nostro gruppo hanno dimostrato che l’ipertensione in gravidanza è associata ad un aumento della popolazione di cellule NK attivate nella placenta in base all’espressione dei marcatori di attivazione superficiale. Questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per valutare la funzione citotossica delle cellule NK isolate da placenta in un modello animale di tipo preeclampsia di ischemia placentare indotta chirurgicamente. I seguenti passaggi sono descritti in dettaglio: generazione di sospensione a singola cellula, isolamento delle cellule NK, stimolazione ex vivo, effector: co-coltura cellulare bersaglio e saggio di citotossicità.
Introduction
La preeclampsia è un disturbo ipertensivo della gravidanza caratterizzato da restrizione della crescita fetale, danno dell’organo finale e attivazione immunitaria cronica. L’attivazione immunitaria cronica nelle donne con preeclampsia porta ad un aumento delle citochine infiammatorie circolanti e placentare, uno squilibrio nelle popolazioni di cellule T CD4+ e un aumento della popolazione di cellule di Natural Killer (NK) attivate1. Studi recentemente pubblicati dal nostro laboratorio dimostrano un ruolo per le cellule NK nel causare alcune della fisiopatologia associata alla preeclampsia nel modello ratto di preeclampsia della pressione di perfusione uterina ridotta (RUPP). Utilizzando la citometria a flusso per misurare l’espressione superficiale dei marcatori di attivazione sulle cellule NK, è stata osservata una maggiore popolazione di cellule NK attivate nella circolazione e nelle placenta dei ratti Rupp rispetto ai ratti normali in gravidanza (NP)2.
Per confermare le osservazioni di citometria a flusso, sono stati condotti studi funzionali per valutare l’attività citotossica delle cellule NK isolate dai placenta dei ratti NP e Rupp. Esistono diversi metodi disponibili per la valutazione della funzione citotossica delle cellule T CD8+ citotossiche e delle cellule NK. Lo standard Gold per l’analisi citotossica funzionale è il saggio di rilascio di cromo3. Altri protocolli sviluppati utilizzati includono citometria a flusso4, citometria a immagine5, calceina rilascio6, e più recentemente bioluminescenza7. Questo video fornirà un protocollo dettagliato sull’utilizzo del saggio di rilascio di lattato deidrogenasi (LDH) ben consolidato per misurare la funzione citotossica delle cellule NK utilizzando un kit di saggio di citotossicità LDH disponibile in commercio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono una serie di importanti note chiave da considerare per ottenere risultati ottimali. La sterilità delle cellule utilizzate è molto importante. Dopo la raccolta della placenta, è importante che la preparazione e l’isolamento delle cellule NK siano eseguiti in condizioni sterili in un armadietto di biosicurezza. Inoltre, poiché tutte le cellule rilasciano LDH su danno cellulare, si deve prestare attenzione a ottenere un’elevata vitalità delle cellule NK dopo l’isolamento e durante il processo di co-coltura. Un …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart Lung e Blood Institute degli istituti nazionali di salute sotto sovvenzione R00HL130456, l’Istituto nazionale di scienze mediche generali degli istituti nazionali di salute sotto il premio P20GM104357, e dal Mississippi INBRE, finanziato da un premio di sviluppo istituzionale (IDeA) presso gli istituti nazionali di scienze mediche generali degli istituti nazionali di salute con il numero di sovvenzione P20GM103476. Il contenuto è esclusivamente responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dei National Institutes of Health.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
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