एक थाली आधारित Cytotoxicity चूहा अपरा प्राकृतिक हत्यारा सेल Cytolytic समारोह के मूल्यांकन के लिए परख
Summary
यहां, हम अलग और एक वर्णमितीय प्लेट परख द्वारा placentas से प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन करने के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करते हैं । कम गर्भाशय छिड़काव अपरा ischemia के दबाव चूहा मॉडल एंटीबॉडी-mediated अलगाव और प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन प्रदर्शित करने के लिए चुना गया था ।
Abstract
यह सर्वविदित है कि डेडुड्युल नेचुरल किलर (एनके) कोशिकाएं सामान्य गर्भावस्था की स्थापना और रखरखाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं । हाल के अध्ययनों में परिसंचारी और महिलाओं को जो इस तरह के आवर्ती गर्भपात और preeclampsia के रूप में प्रतिकूल गर्भावस्था जटिलताओं से पीड़ित में decidual एनके कोशिकाओं की एक बदल आबादी का प्रदर्शन किया है । हमारे समूह से अध्ययन से पता चला है कि गर्भावस्था में उच्च रक्तचाप सतह सक्रियण मार्कर की अभिव्यक्ति के आधार पर अपरा में सक्रिय एनके कोशिकाओं की एक वृद्धि की आबादी के साथ जुड़ा हुआ है । इस पांडुलिपि एक विस्तृत करने के लिए एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह का आकलन करने के लिए प्रदान करता है एक preeclampsia की तरह पशु मॉडल में placentas की शल्य चिकित्सा प्रेरित अपरा ischemia । निंनलिखित चरणों का विस्तार से वर्णन किया गया है: एकल कोशिका निलंबन, एनके सेल अलगाव, पूर्व vivo उत्तेजना, effector का उत्पादन: लक्ष्य सेल सह संस्कृति, और साइटोटॉक्सिसिटी परख ।
Introduction
Preeclampsia भ्रूण विकास प्रतिबंध, अंत अंग क्षति और क्रोनिक प्रतिरक्षा सक्रियण की विशेषता गर्भावस्था के एक ग्रस्त विकार है । क्रोनिक preeclampsia के साथ महिलाओं में प्रतिरक्षा सक्रियण बढ़ परिसंचारी और अपरा भड़काऊ cytokines, सीडी 4 में असंतुलन+ टी कोशिकाओं आबादी, और सक्रिय प्राकृतिक हत्यारा (NK) कोशिकाओं1की वृद्धि हुई जनसंख्या की ओर जाता है । हाल ही में हमारी प्रयोगशाला द्वारा प्रकाशित अध्ययनों में एनके कोशिकाओं के लिए एक भूमिका का प्रदर्शन कम गर्भाशय Perfusion दबाव (RUPP) preeclampsia के चूहे मॉडल में preeclampsia के साथ जुड़े pathophysiology के कुछ कारण । प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए एनके कोशिकाओं पर सक्रियण मार्कर की सतह अभिव्यक्ति को मापने के लिए, परिसंचरण में सक्रिय एनके कोशिकाओं की एक वृद्धि की आबादी और RUPP चूहों की सामांय गर्भवती (एनपी) चूहों की तुलना में placentas2मनाया गया ।
प्रवाह कोशिका-मिति टिप्पणियों की पुष्टि करने के लिए, एन के placentas से अलग NP और RUPP चूहों के साइटोटोक्सिक गतिविधि का आकलन करने के लिए कार्यात्मक अध्ययन किया गया । साइटोटोक्सिक सीडी 8+ टी कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह के मूल्यांकन के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं । कार्यात्मक साइटोटोक्सिक विश्लेषण के लिए सोने के मानक क्रोमियम रिलीज परख3है । अंय विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग किया प्रवाह कोशिका मिति4, छवि cytometry5, calcein रिलीज6, और सबसे हाल ही में bioluminescence7शामिल हैं । यह वीडियो अच्छी तरह से स्थापित लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (ldh) जारी परख का उपयोग करने के लिए एनके कोशिकाओं के साइटोटोक्सिक समारोह एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ldh साइटोटोक्सिक परख किट का उपयोग करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वहां महत्वपूर्ण प्रमुख नोटों की एक संख्या के लिए इष्टतम परिणामों के लिए विचार कर रहे हैं । उपयोग की गई कोशिकाओं की बंध्यता बहुत महत्वपूर्ण है । नाल के संग्रह के बाद, यह महत्वपूर्ण है कि तैयारी और एनके क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के राष्ट्रीय स्वास्थ्य के दिल फेफड़ों और रक्त संस्थान अनुदान R00HL130456, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के राष्ट्रीय संस्थानों के जनरल मेडिकल साइंसेज के तहत पुरस्कार P20GM104357 के तहत, और द्वारा समर्थित किया गया था मिसिसिपी INBRE, अनुदान संख्या P20GM103476 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सामांय चिकित्सा विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थानों से एक संस्थागत विकास पुरस्कार (विचार) द्वारा वित्त पोषित । सामग्री केवल लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है ।
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
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