Un dosage de cytotoxicité à base de plaques pour l’évaluation de la fonction cytolytique des cellules tueuses naturelles du rat placentaire
Summary
Ici, nous fournissons une méthodologie détaillée pour isoler et évaluer la fonction cytotoxique des cellules tueuses naturelles de placentas par un dosage de la plaque colorimétrique. Le modèle de rat à pression de perfusion utérine réduit de l’ischémie placentaire a été choisi pour démontrer l’isolement et l’évaluation par médiation des anticorps de la fonction cytotoxique des cellules tueuses naturelles.
Abstract
Il est bien connu que les cellules du tueur naturel (NK) déciduelles jouent un rôle crucial dans l’établissement et le maintien d’une grossesse normale. Des études récentes ont montré une population altérée de cellules NK circulantes et décibiales chez les femmes qui souffrent de complications de grossesse défavorables telles que la fausse couche récurrente et la prééclampsie. Des études de notre groupe ont montré que l’hypertension dans la grossesse est associée à une population accrue de cellules NK activées dans le placenta en fonction de l’expression des marqueurs d’activation de surface. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour évaluer la fonction cytotoxique des cellules NK isolées des placentas dans un modèle animal de type prééclampsie d’ischémie placentaire induite chirurgicalement. Les étapes suivantes sont décrites en détail: génération de suspension à cellule unique, isolement cellulaire NK, stimulation ex vivo, effecteur: co-culture des cellules cibles et dosage de la cytotoxicité.
Introduction
La prééclampsie est un trouble hypertensif de la grossesse caractérisé par la restriction de croissance fœtale, les lésions des organes finaux et l’activation immunitaire chronique. L’activation immunitaire chronique chez les femmes atteintes de prééclampsie conduit à une augmentation de la circulation et des cytokines inflammatoires placentaires, un déséquilibre dans les cellules CD4+ T populations, et une population accrue de cellules de tueur naturel (NK) activées1. Les études récemment publiées par notre laboratoire démontrent un rôle pour les cellules NK en provoquant une partie de la pathophysiologie associée à la prééclampsie dans le modèle de rat de prééclampsie de la pression de perfusion utérine réduite (RUPP). En utilisant la cytométrie en flux pour mesurer l’expression de la surface des marqueurs d’activation sur les cellules NK, on a observé une augmentation de la population des cellules NK activées dans la circulation et les placentas des rats RUPP comparativement aux rats normaux gravides (NP)2.
Pour confirmer les observations de cytométrie en flux, des études fonctionnelles pour évaluer l’activité cytotoxique des cellules NK isolées des placentas des rats NP et RUPP ont été effectuées. Il existe plusieurs méthodes disponibles pour l’évaluation de la fonction cytotoxique des cellules cytotoxiques de l+ T et des cellules NK. La norme d’or pour l’analyse cytotoxique fonctionnelle est le test de libération du chrome3. D’autres protocoles développés utilisés incluent cytométrie en flux4, cytométrie d’image5, calcéine Release6, et plus récemment bioluminescence7. Cette vidéo fournira un protocole détaillé sur l’utilisation du dosage bien établi de la lactate déshydrogénase (LDH) pour mesurer la fonction cytotoxique des cellules NK à l’aide d’un kit de dosage de cytotoxicité LDH disponible dans le commerce.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il y a un certain nombre de notes clés importantes à considérer pour des résultats optimaux. La stérilité des cellules utilisées est très importante. Après la collecte du placenta, il est important que la préparation et l’isolement des cellules NK soient effectuées dans des conditions stériles dans un cabinet de biosécurité. En outre, parce que toutes les cellules libèrent LDH sur les dommages cellulaires, il faut prendre soin d’obtenir une grande viabilité des cellules NK après l’isolement et Pend…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par l’Institut national de cardiopathie et de sang des instituts nationaux de la santé sous la subvention R00HL130456, l’Institut national des sciences médicales générales des instituts nationaux de la santé sous le prix P20GM104357, et par le Mississippi INBRE, financé par un prix de développement institutionnel (IDeA) des instituts nationaux de sciences médicales générales des instituts nationaux de la santé sous le numéro de subvention P20GM103476. Le contenu est uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des instituts nationaux de la santé.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
