Een plaat-gebaseerde chemo test voor de beoordeling van de rat placenta Natural Killer Cell cytolytische functie
Summary
Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren en beoordelen van de chemo-functie van Natural killer cellen van placentas door een colorimetrische plaat assay. De verminderde uteriene bloeddruk rat model van placentale ischemie werd gekozen om de antilichaam-gemedieerde isolatie en beoordeling van de chemo-functie van Natural killer cellen aan te tonen.
Abstract
Het is algemeen bekend dat deciduale Natural Killer (NK) cellen een cruciale rol spelen bij het opzetten en onderhouden van een normale zwangerschap. Recente studies hebben aangetoond een veranderde populatie van circulerende en deciduale NK cellen bij vrouwen die last hebben van ongunstige zwangerschap complicaties, zoals terugkerende miskraam en Preeclampsia. De studies van onze groep hebben aangetoond dat de hypertensie in zwangerschap met een verhoogde bevolking van geactiveerde NK cellen in de placenta wordt geassocieerd die op de uitdrukking van de markeringen van de oppervlakte activering wordt gebaseerd. Dit manuscript geeft een gedetailleerd protocol om de chemo-functie van NK-cellen geïsoleerd van placenta in een Preeclampsia dierlijk model van chirurgisch geïnduceerde placenta ischemie te beoordelen. De volgende stappen worden in detail beschreven: generatie van één cel schorsing, NK cel isolatie, ex vivo stimulatie, effect: doel cel co-cultuur, en de chemo analyse.
Introduction
Preeclampsia is een hypertensieve wanorde van zwangerschap die door foetale de groeibeperking, eind orgaanschade en chronische immune activering wordt gekenmerkt. Chronische immuun activering bij vrouwen met Preeclampsia leidt tot verhoogde circulerende en placenta inflammatoire cytokines, een onevenwichtigheid in CD4+ T cellen populaties, en een verhoogde populatie van activated Natural Killer (NK) cellen1. Studies onlangs gepubliceerd door ons lab tonen een rol voor NK-cellen in het veroorzaken van een aantal van de pathofysiologie geassocieerd met Preeclampsia in de verminderde uteriene bloeddruk (RUPP) Rat model van Preeclampsia. Gebruikend Stroom Cytometry om oppervlakte uitdrukking van activerings markeringen op NK cellen te meten, werd een verhoogde bevolking van geactiveerde NK cellen in de omloop en de placentas van RUPP ratten in vergelijking met normale zwangere (NP) ratten waargenomen2.
Om de flow Cytometry observaties te bevestigen, werden functionele studies uitgevoerd om de chemo activiteit van NK-cellen die geïsoleerd zijn van de placenta van NP en RUPP ratten te beoordelen. Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor de beoordeling van de chemo functie van chemo CD8+ T-cellen en NK-cellen. De gouden standaard voor functionele chemo-analyse is de chromium-vrijgave assay3. Andere ontwikkelde protocollen gebruikt omvatten flow Cytometry4, image Cytometry5, calceïne release6, en meest recent bioluminescentie7. Deze video zal een gedetailleerd protocol over het gebruik van de gerenommeerde lactaatdehydrogenase (LDH) release assay te meten chemo-functie van NK-cellen met behulp van een commercieel beschikbare LDH chemo graad assay kit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn een aantal belangrijke belangrijkste nota’s om voor optimale resultaten te overwegen. De steriliteit van de gebruikte cellen is zeer belangrijk. Na het verzamelen van de placenta is het belangrijk dat de voorbereiding en isolatie van de NK-cellen onder steriele omstandigheden in een Biosafety-kabinet wordt uitgevoerd. Omdat alle cellen LDH op cellulaire beschadigingen vrijgeven, moet er ook voor worden gezorgd dat NK-cellen na isolatie en tijdens het co-cultuur proces een hoge levensvatbaarheid krijgen. Te veel s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door het nationale Instituut van de hart Long en van het bloed van de nationale instituten van gezondheid onder toelage R00HL130456, het nationale Instituut van algemene medische wetenschappen van de nationale instituten van gezondheid onder toekenning P20GM104357, en door Mississippi INBRE, gefinancierd door een Institutional Development Award (IDeA) van de nationale instituten van de algemene medische wetenschappen van de nationale instituten voor gezondheid onder Grant Number P20GM103476. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de nationale instituten van de gezondheid.
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
