Her giver vi en detaljeret metodologi til at isolere og vurdere cytotoksiske funktion af naturlige dræber celler fra indsamlingerne ved en kolorimetrisk plade assay. Den reducerede livmoder perfusion tryk rotte model af placenta iskæmi blev valgt til at demonstrere antistof-medieret isolation og vurdering af den cytotoksiske funktion af naturlige dræber celler.
Det er velkendt, at decidobbelte naturlige dræber (NK) celler spiller en afgørende rolle i etablering og vedligeholdelse af normal graviditet. Nylige undersøgelser har vist en ændret population af cirkulerende og decidobbelte NK-celler hos kvinder, der lider af ugunstige graviditetskomplikationer, såsom recidiverende abort og præeklampsi. Undersøgelser fra vores gruppe har vist, at hypertension under graviditet er forbundet med en øget population af aktiverede NK celler i placenta baseret på udtryk for overflade aktiverings markører. Dette manuskript indeholder en detaljeret protokol til vurdering af den cytotoksiske funktion af NK-celler isoleret fra placenta i en preeclampsia-lignende dyremodel af kirurgisk induceret placenta iskæmi. Følgende trin er beskrevet i detaljer: generering af enkelt cellesuspension, NK celle isolation, ex vivo stimulation, effektor: målcelle Co-kultur, og cytotoksicitet assay.
Preeclampsia er en hypertensiv lidelse af graviditeten karakteriseret ved føtale vækst begrænsning, ende organskader og kronisk immun aktivering. Kronisk immun aktivering hos kvinder med præeklampsi fører til øget cirkulerende og placenta inflammatoriske cytokiner, en ubalance i CD4+ T- celler populationer, og en øget population af aktiverede Natural Killer (NK) celler1. Undersøgelser for nylig offentliggjort af vores laboratorium demonstrere en rolle for NK celler i forårsager nogle af Patofysiologi forbundet med preeklampsia i reduceret uterine perfusion Pressure (Rupp) rotte model af præeklampsi. Ved hjælp af flowcytometri til måling af overflade udtryk for aktiverings markører på NK-celler blev der observeret en øget population af aktiverede NK-celler i cirkulation og indsamlingerne af Rupp-rotter sammenlignet med normale drægtige (NP) rotter2.
For at bekræfte flow cytometri observationer blev der udført funktionelle undersøgelser til vurdering af den cytotoksiske aktivitet af NK-celler isoleret fra indsamlingerne af NP og Rupp-rotter. Der er flere metoder til rådighed til vurdering af cytotoksiske funktion af cytotoksiske CD8+ T celler og NK celler. Den gyldne standard for funktionel cytotoksisk analyse er chrom Release assay3. Andre udviklede protokoller anvendes omfatter flow cytometri4, billede cytometri5, calcein Release6, og senest bioluminescens7. Denne video vil give en detaljeret protokol om brug af den veletablerede lactat dehydrogenase (LDH) frigivelse assay til at måle cytotoksiske funktion af NK celler ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt LDH cytotoksicitet assay kit.
Der er en række vigtige nøgle noter at overveje for optimale resultater. Steriliteten af de anvendte celler er meget vigtigt. Efter opsamling af placenta er det vigtigt, at klargøring og isolering af NK-cellerne udføres under sterile forhold i et biosikkerhedskabinet. Da alle celler frigiver LDH ved cellulære skader, skal der desuden udvises omhu for at opnå en høj levedygtighed af NK-cellerne efter isolation og under samkulturprocessen. For meget spontan LDH-frigivelse fra NK-cellerne kan ofte resultere i negativ…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af national Heart Lung og Blood Institute af National Institutes of Health under Grant R00HL130456, National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tildeling P20GM104357, og ved Mississippi INBRE, finansieret af en institutionel Udviklingspris (IDeA) fra National Institutes of General Medical Sciences af National Institutes of Health under tilskudsnummer P20GM103476. Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra de nationale sundhedsinstitutter.
1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
T25 flask | Corning | 430639 | |
Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |