一种基于板的大鼠胎盘自然杀伤细胞细胞细胞溶解功能评价的细胞毒性测定
Summary
在这里, 我们提供了一个详细的方法, 以分离和评估细胞毒性功能的自然杀伤细胞从胎盘通过比色板分析。选择减少子宫灌注压力大鼠胎盘缺血模型, 以证明其抗体介导的分离和对自然杀伤细胞细胞毒性功能的评估。
Abstract
众所周知, 决定性自然杀伤细胞 (NK) 在正常妊娠的建立和维持中发挥着至关重要的作用。最近的研究表明, 患有反复流产和先兆子宫炎等不良妊娠并发症的妇女的循环和卵形 NK 细胞数量发生了变化。我们组的研究表明, 根据表面激活标记的表达, 妊娠期高血压与胎盘中激活的 NK 细胞数量增加有关。本手稿提供了一个详细的方案, 以评估从胎盘分离出的 NK 细胞的细胞毒性功能, 在手术诱导的胎盘缺血的前激素样动物模型中。详细介绍了以下步骤: 单细胞悬浮液的产生、NK 细胞分离、体外刺激、效应因子: 靶细胞共培养和细胞毒性试验。
Introduction
先兆子宫炎是一种妊娠期高血压疾病, 其特征是胎儿生长受限、终末期器官损伤和慢性免疫激活。先兆子宫炎妇女的慢性免疫激活导致循环和胎盘炎性细胞因子增加, CD4+ t 细胞数量不平衡, 激活的自然杀手 (nk) 细胞1的数量增加。我们实验室最近发表的研究表明, 在子宫炎先兆大鼠模型中, NK 细胞在引起一些与先兆子宫炎相关的病理生理学方面发挥了重要作用。采用流式细胞仪测量 NK 细胞活化标记的表面表达, 观察到与正常怀孕大鼠相比, RUPP 大鼠在循环和胎盘中激活的 NK 细胞数量增加2。
为证实流式细胞仪观察结果, 进行了功能研究, 以评估从 NP 和 RUPP 大鼠胎盘分离出的 NK 细胞的细胞毒性活性。有几种方法可用于评估细胞毒性 CD8+ t 细胞和 nk 细胞的细胞毒性功能。功能细胞毒性分析的黄金标准是铬释放分析3。其他使用的协议包括流式细胞术4, 图像细胞术5, 钙素释放6, 最近的生物发光7。本视频将提供一个详细的协议, 使用成熟的乳酸脱氢酶 (LDH) 释放检测测量 NK 细胞的细胞毒性功能使用一个商业上可用的 LDH 细胞毒性检测试剂盒。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了获得最佳效果, 有许多重要的关键注意事项需要考虑。所利用的细胞的不育是非常重要的。在收集胎盘后, 重要的是在生物安全柜的无菌条件下制备和隔离 NK 细胞。此外, 由于所有细胞在细胞损伤时都会释放 LDH, 因此应注意在分离后和共培养过程中获得高活力的 NK 细胞。NK 细胞中过多的自发 LDH 释放通常会导致负面的、无法使用的数据
此协议的某些方面将特定于用户及其?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家卫生研究院国家心脏肺和血液研究所的支持, 该研究所获得了 R00HL130456 赠款, 国家卫生研究院普通医学科学研究所获得了 P20GM104357 奖, 并得到了密西西比州 INBRE, 由国家卫生研究院国家普通医学研究所颁发的机构发展奖 (IDeA) 资助, 赠款号为 P20GM103476。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。
Materials
| 1.5 mL Eppendorf tube | Fisher | 5408129 | |
| 100 µL Filter | Fisher | 22363549 | Nylon Mesh |
| 15 mL conical tube | Fisher | 0553859A | |
| 3 mL syringe | Fisher | 14823436 | |
| 50 mL conical tube | Fisher | 7203510 | |
| 6-well cell culture plate | Corning | 720083 | |
| 96-well Tissue Culture Plate | CELLTREAT | 229190 | Sterile, Round Bottom |
| AOPI | Nexcelom | CS201065ML | |
| Cell scraper | Fisher | 8100241 | |
| Cellometer Disposable Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100 | |
| Cellometer Vision Image Cytometer | Nexcelom | N/A | |
| Cytotox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit | Promega | G1780 | |
| Dynabeads Flowcomp Flexi Kit | Invitrogen | 11061D | |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 12321D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS-100G | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Flow Cytometry Tube | Corning | 352008 | |
| Lymphoprep | Fisher | NC0460539 | Density gradient medium; 4 x 250 mL |
| PBS | Fisher | SH3025801 | 10 x 500 mL |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Petri dishes | Fisher | 9720500 | Without Pad |
| Purified Mouse anti-Rat CD161a | BD Biosciences | 555006 | |
| Purified Mouse anti-Rat CD3 | BD Biosciences | 554829 | |
| Recombinant Rat IL-2 | R&D Systems | 502-RL | |
| RPMI | Gibco | 11875135 | 1640 Medium |
| T25 flask | Corning | 430639 | |
| Trypsin | ThermoFisher | 15090046 | |
| YAC-1 cell | ATCC | TIB-160 |
Referências
- Cornelius, D. C., Cottrell, J., Amaral, L. M., LaMarca, B. Inflammatory Mediators: A causal link to hypertension during pregnancy- Studies in Preeclampsia. British Journal of Pharmacology. , (2018).
- Elfarra, J., et al. Natural killer cells mediate pathophysiology in response to reduced uterine perfusion pressure. Clinical Science. 131 (23), 2753-2762 (2017).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14 (2), 181-196 (1968).
- Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. Journal of Immunological Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
- Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), 0141074 (2015).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), 89357 (2014).
- Caporossi, C., Nogueira, P. L., Marques, J. C., Assis, R. M., Aguilar-Nascimento, J. E. Validation of the gastroschisis experimental model and the influence of the mother’s diet enriched with glutamine in the fetal morphology. Acta Cirúrgica Brasileira. 29 (3), 158-165 (2014).
- Lv, L. H., et al. Functional distinction of rat liver natural killer cells from spleen natural killer cells under normal and acidic conditions in vitro. Hepatobiliary and Pancreatic Diseases International. 11 (3), 285-293 (2012).
- Flieger, D., et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 1-13 (1995).
- Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Annals of Clinical Laboratory Science. 42 (1), 42-49 (2012).
