Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung
Summary
Mutationen im Leucin-reichen Repeatkinase-2-Gen (LRRK2) verursachen eine erbliche Parkinson-Krankheit. Wir haben eine einfache und robuste Methode zur Beurteilung der LRRK2-kontrollierten Phosphorylierung von Rab10 bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen entwickelt. Dies kann helfen, Personen mit erhöhter LRRK2-Kinase-Signalweg-Aktivität zu identifizieren.
Abstract
Die leucinreiche Wiederholungskinase 2 (LRRK2) ist das am häufigsten mutierte Gen bei der erblichen Parkinson-Krankheit (PD) und alle pathogenen LRRK2-Mutationen führen zu einer Hyperaktivierung seiner Kinase-Funktion. Hier beschreiben wir einen einfachen und robusten Test zur Quantifizierung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität bei menschlichen peripheren Blutneutrophilen, indem wir die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung eines seiner physiologischen Substrate, Rab10 bei Threonin 73, messen. Die beschriebene Immunoblotting-Analyse erfordert einen vollständig selektiven und phosphospezifischen Antikörper, der das von LRRK2 phosphorylierte Rab10 Thr73-Epitop erkennt, wie z. B. den monoklonalen Antikörper MJFF-pRab10 Kaninchen. Es verwendet menschliche periphere Blutneutrophilen, weil peripheres Blut leicht zugänglich ist und Neutrophile ein reichlicher und homogener Bestandteil sind. Wichtig ist, dass Neutrophile relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 und Rab10 ausdrücken. Ein potenzieller Nachteil von Neutrophilen ist ihre hohe intrinsische Serinproteaseaktivität, die die Verwendung sehr potenter Proteasehemmer wie dem Organophosphor-Neurotoxin Diisopropylfluorphosphat (DIFP) als Teil des Lysepuffers erfordert. Dennoch sind Neutrophile eine wertvolle Ressource für die Erforschung der LRRK2-Kinase-Signalwegaktivität in vivo und sollten für die Aufnahme in PD-Biorepository-Sammlungen in Betracht gezogen werden.
Introduction
Versuche, die Parkinson-Krankheit (PD) zu verlangsamen oder zu stoppen, sind bisher gescheitert. Die Entdeckung hyperaktivierender Mutationen in der leucinreichen Repeatkinase 2 (LRRK2), die das Risiko für PD verursachen und/oder erhöhen, hat zur Entwicklung von LRRK2-Kinase-Inhibitoren1,2,3geführt. Diese sind nun in klinische Studien aufgenommen4. Die genaue Funktion von LRRK2 ist unklar, aber ein großer Fortschritt war die Identifizierung einer Teilmenge von Rab GTPase Proteinen, einschließlich Rab10, als die ersten gutgläubigen physiologischen Substrate der LRRK2 Kinase5,6,7. Die wichtigsten Herausforderungen im Zeiten der krankheitsmodifizierenden Therapeutika sind biochemische Marker des LRRK2-Kinase-Aktivierungsstatus und das gezielte Engagement von LRRK2-Kinase-Inhibitoren.
Bisher war der wichtigste pharmakokinetische Marker für LRRK2-Inhibitoren in vivo ein Cluster konstitutiv phosphorylierter Serinrückstände von LRRK2, insbesondere Serin 935, die als Reaktion auf verschiedene LRRK2-Inhibitoren8,9dephosphoryliert werden. Die serinfarbene 935-Phosphorylierung korreliert jedoch nicht mit der intrinsischen zellulären LRRK2-Kinase-Aktivität, da sie nicht direkt von LRRK2 phosphoryliert wird und immer noch in Kinase-inaktivem LRRK210phosphoryliert wird. Die LRRK2-Kinase-Aktivität korreliert gut mit der Autophosphorylierung des Serins 1292, ist aber praktisch keine geeignete Auslesung für die endogene LRRK2-Kinase-Aktivität durch Immunoblot-Analyse ganzer Zellextrakte aufgrund des aktuellen Mangels an zuverlässigen und phosphospezifischen Antikörpern für diese Stelle10,11.
Wir haben einen robusten und einfachen Test entwickelt, um die Aktivität des LRRK2-Kinase-Signalwegs in menschlichen peripheren Blutzellen zu quantifizieren, der die LRRK2-kontrollierte Phosphorylierung seines physiologischen Zielproteins Rab10 an Threonin 7311misst. Peripheres Blut ist leicht zugänglich durch Venesection, Das ist ein geringes Risiko und schnelle Verfahren, das minimale Beschwerden verursacht. Wir konzentrieren uns auf menschliche periphere Blutneutrophile, weil sie eine reichliche (37-80% aller weißen Blutkörperchen) und homogene Zellpopulation, die relativ hohe Konzentrationen von LRRK2 undRab11ausdrückt. Darüber hinaus können periphere Blutneutrophile schnell und effizient isoliert werden, indem ein immunmagnetischer negativer Ansatz verwendet wird. Um sicherzustellen, dass die anschließende beobachtete Rab10-Phosphorylierung durch LRRK2 vermittelt wird, wird jede Charge Neutrophilen mit oder ohne potenten und selektiven LRRK2-Kinase-Inhibitor inkubiert (wir verwenden und empfehlen MLi-2)2,12. Es folgt eine Zelllyse in einem Puffer, der den Protease-Inhibitor Diisopropylfluorphosphat (DIFP) enthält, der zur Unterdrückung der intrinsischen Serinproteaseaktivität notwendig ist, die bei Neutrophilen bekannt ist13. Für die abschließende Analyse durch quantitative Immunoblotting empfehlen wir die Verwendung des monoklonalen Antikörpers MJFF-pRab10 Kaninchen, der das Rab10 Thr73-Phosphoepitop spezifisch detektiert und nicht mit anderen phosphorylierten Rab-Proteinen14kreuzreagiert. Selektivität und Spezifität dieses Antikörpers wurden in Überexpressionsmodellen verschiedener Rab-Proteine und einer A549 Rab10-Knock-out-Zelllinie14validiert. So messen wir den Unterschied in der Rab10-Phosphorylierung in neutrophilen Lysaten, die mit und ohne einen potenten und selektiven LRRK2-Kinase-Inhibitor2behandelt wurden. Alternativ könnten Proben auch mit anderen Methoden, wie z. B. der quantitativen Massenspektrometrie, analysiert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die LRRK2-gesteuerte Rab10-Phosphorylierung ein überlegener Marker der LRRK2-Kinase-Aktivität zur LRRK2-Phosphorylierung bei Serin 935 und humanen peripheren Blutneutrophilen ist eine wertvolle Ressource für die PD-Forschung zu LRRK2. Unser Protokoll bietet einen robusten und einfachen Test zur Abhörung der LRRK2-Signalwegaktivität bei peripheren Blutneutrophilen und ermöglicht eine biochemische Schichtung von Personen mit erhöhter LRRK2-Kinaseaktivität15. Wichtig ist, dass solche Personen von der zukünftigen Behandlung von LRRK2-Kinase-Hemmern profitieren können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Überzeugende klinische, genetische und biochemische Beweise deuten auf eine wichtige Rolle für LRRK2 und insbesondere seine Kinase-Funktion bei der Parkinson-Krankheithin 7. LRRK2-Kinase-Inhibitoren wurden entwickelt und gehen in klinische Studien2,4,12. Daher ist es notwendig, LRRK2 als Biomarker für das Zielengagement sowie die Patientenschichtung zu nutzen. Unser Protokoll beschreibt einen robusten …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den gesunden Freiwilligen, die freundlicherweise Blut gespendet haben, für die vorliegende Studie. Wir danken der Michael J. Fox Foundation for Parkinson es Research (MJFF) und der Fox BioNet Studienleitung (FBN) für ihre Unterstützung und Ihren Beitrag zum schriftlichen Protokoll und Video. Wir danken Professor Alexander Zimprich von der Universität Wien in Österreich für die Prüfung unseres Protokolls und der Zusammenarbeit. Wir schätzen die Beiträge von Paul Davies zum Projekt (Geschäftsführer der MRC PPU). Wir würdigen auch die hervorragende technische Unterstützung der MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit (PPU), nämlich Chemical Synthesis (Natalia Shpiro für die Synthese von MLi-2), MRC PPU Reagents und Services Antikörper-Reinigungsteams (koordiniert von Hilary McLauchlan und James Hastie). Wir danken Mhairi Towler und Fraser Murdoch von Vivomotion für ihre Hilfe bei der Herstellung der Videos und Animationen. Wir danken Steve Soave aus 81 Filmen für die Unterstützung bei den letzten Bearbeitungen. Esther Sammler wird von einem Scottish Senior Clinical Academic Fellowship unterstützt und wurde von Parkinson es UK (K-1706) gefördert.
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
Referências
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