Muy largo leer la secuencia para el análisis de la DNA de Genomic entero

Nota: El protocolo de NLR-seq consta de tres pasos consecutivos: 1) extracción de peso molecular alto peso (HMW) ADN genómico; 2) ultra largo DNA biblioteca de la construcción, que incluye la fragmentación del ADN de HMW en los tamaños deseados y la ligadura de adaptadores de secuenciación del ADN termina; y 3) carga de la DNA adaptador de ligarse a los arreglos de discos de interconectivos (figura 1). 1. extracción de ADN de HMW Configuración de reactivos. Hacer 1 x de tampón de solución salina tamponada (PBS) fosfato (1.000 mL), añadir 100 mL de PBS (10 x) en 900 mL de agua y mezclar bien. Hacer el tampón de lisis (50 mL) añadiendo 43,5 mL de agua a un tubo de 50 mL. Añadir 500 μL de Tris (1 M, pH 8.0), 1 mL de cloruro de sodio (NaCl) (5 M), 2,5 mL de ácido etilendiaminotetracético (EDTA) (0,5 M, pH 8.0) y 2,5 mL de sodio dodecil sulfato (SDS) (10%, peso/vol) en el tubo y mezclar bien.Nota: Este tampón PBS puede almacenarse a 4 ° C hasta por 6 meses. El tampón de lisis predefinidos puede almacenarse a temperatura ambiente para hasta 2 meses. Verificar la mortalidad celular y contar las células. Asegúrese de que la relación viva es > 85% y el número total de células es de 30 x 106.Nota: Las células utilizadas en este protocolo son de la línea celular de HG00733, una línea de células linfoblastoides humanas de origen puertorriqueño, ampliamente utilizado en el consorcio del genoma de 1000 para el análisis de la variación estructural (véase tabla de materiales para ordenar información), que pertenece a genoma internacional muestra recursos. Recogen las células por centrifugación a 200 x g durante 5 min a TA. descartar el medio y resuspender el precipitado de células (30 x 106 células) con 5 mL de tampón de PBS 1 x. Centrifugar nuevamente a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante.Nota: 25-35 x 106 células son aceptables para este enfoque. Más variación en la cantidad de células tendrán mayor optimización. El precipitado de células puede almacenarse en el ° C −80 hasta por 6 meses. Resuspender el precipitado de células en 200 μL de tampón de PBS 1 x. Si utiliza un precipitado de células congeladas, lavar con 5 mL de tampón de PBS 1 x. Centrifugue la solución a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 200 μL de 1 x de tampón PBS. Preparar 10 mL de tampón de lisis en un tubo de 50 mL. Añadir la suspensión de 200 μL de células al tampón de lisis y vortex a máxima velocidad para incubar s. 3 la solución a 37 ° C durante 1 hora. Añadir 2 μL de Rnasa A (100 mg/mL) para el lisado. Gire suavemente el tubo de 50 mL para mezclar la muestra. Incubar la solución a 37 ° C durante 1 hora. Añadir proteinasa μL 50 K (20 mg/mL) para el lisado. Gire suavemente el tubo de 50 mL para mezclar la muestra. Incubar la solución a 50 ° C por 2 h. Durante la incubación, mezclar suavemente la muestra cada 30 minutos. Quite el tubo de 50 mL de 50 ° C y dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Añadir 10 mL de la capa de fenol de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1, vol/vol/vol) de lisado y gire el tubo en un mezclador de rotor (véase Tabla de materiales) a temperatura ambiente en una campana de humos a 20 rpm durante 10 minutos envolver la tapa del tubo con parafilm para evitar fugas durante la rotación. Preparar dos tubos de gel de 50 mL (véase Tabla de materiales) por centrifugación a 1.500 x g durante 2 min a TA.Nota: El gel forma una barrera estable entre la fase acuosa que contiene ácido nucleico y el solvente orgánico. Verter la solución de muestra/fenol en uno de los preparados 50 mL tubos de gel de paso 1.10. Centrifugue la solución a 3.000 x g durante 10 min a TA. Vierta el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 mL. Añadir 10 mL de la capa de fenol de alcohol fenol: cloroformo: isoamílico (25:24:1, vol/vol/vol) y gire el tubo en un mezclador de rotor a RT en una campana de humos a 20 rpm durante 10 minutos. Repita el tubo del gel de paso 1.11 una vez con el segundo preparado. Vierta el sobrenadante en un nuevo tubo de 50 mL. Añadir 25 mL de etanol 100% helado y gire suavemente el tubo con la mano hasta que el ADN precipita (figura 2).Nota: El método de precipitación ayuda a estabilizar el ADN de HMW. Doblar una punta de 20 μL para hacer un gancho. Cuidadosamente saque el ADN de HMW con el gancho y deje la gota líquida. Coloque el ADN de HMW en un tubo de 50 mL que contiene 40 mL de etanol al 70%. Lavar el ADN suavemente invirtiendo el tubo 3 veces. Repita el paso 1.15 una vez para recoger el ADN del tubo de etanol al 70%. Coloque el ADN de HMW en un tubo de 2 mL que contiene 1,8 mL de etanol al 70%. Centrifugue el ADN de HMW lavado a 10.000 x g durante 3 s en RT. quitar tanto el etanol residual posible mediante pipeteo.Nota: No molestar el pellet de ADN cuando el etanol residual el pipeteo. Incubar el tubo de 2 mL a 37 ° C por 10 min con la tapa abierta para secar la muestra. Si continúa con el paso 2.1 (con esquila mecánica y 1 Kit de secuenciación de la ligadura de D), añadir 1 mL de TE (10 mM Tris y 1 mM EDTA, pH 8.0) para el tubo de 2 mL. Si continúa con el paso 2.2 (con fragmentación basada en la transposasa y Kit rápido de la secuencia), añadir 200 μL de 10 mM Tris (pH 8.0), 0.02% Tritón X-100.Nota: No molestar el pellet de DNA. Dejar el tubo reposar a 4 ° C en oscuridad 48 h ayudará la muestra resuspender completamente. El ADN de HMW pueden almacenarse a 4 ° C hasta por 2 semanas. Tiempo de almacenamiento u otras condiciones de almacenamiento de información pueden introducir más pequeños fragmentos. 2. Ultra largo DNA biblioteca de la construcción Nota: Hay dos formas de construir las bibliotecas de ADN muy largas basadas en dos métodos diferentes de corte juntados con kits de secuenciación nanopore. Una biblioteca de base de esquila mecánica produce datos con una N50 de 50-70 kb, teniendo alrededor de 8 h para la construcción de la biblioteca. Una biblioteca basada en la fragmentación de la transposasa produce una N50 de 90-100 kb de datos, tomando sólo 90 min para la construcción de la biblioteca. El protocolo de corte mecánico da mayor rendimiento desde el mismo ADN de entrada utilizar versiones idénticas de adaptador de la secuencia y calidad de las células de flujo nanopore. Construcción de biblioteca base de esquila mecánica Descongelar y mezclar los reactivos de la ligadura kit (véase Tabla de materiales). Deshielo FFPE ADN reparación final dA/reparación-tailing tampón en el hielo, entonces el vórtice y búfer y exprimido hasta la mezcla. Descongele la mezcla de adaptador (AMX) y adaptador grano enlace buffer (ABB) en hielo, después pipeta y vuelta abajo para mezclar. Deshielo bajando buffer de combustible (RBF) y tampón de elución (ELB) en RT, entonces vortex y vuelta a mezclar. Descongele la biblioteca carga granos (LLB) en RT y pipeta para mezclar antes de usar. Una vez descongelado, mantenga todos los componentes del kit en el hielo. Sacar las enzimas sólo cuando sea necesario. Llevar las bolas magnéticas a RT de uso.Nota: Recomendaciones sobre las bolas magnéticas a utilizar consulte la tabla de materiales. Compruebe la calidad y cantidad del ADN de HMW de paso 1.21.1. Pipeta de 20 μL de ADN en nuevos tubos de 1,5 mL de tres lugares diferentes en el tubo de ADN de HMW con P200 amplia dio consejos. Toma 1 μL de las tres alícuotas para detectar la concentración con un fluorómetro y la calidad, utilizando una lectura de UV. Revise varias veces para confirmar los resultados.Nota: Los resultados esperados se muestran en la Figura 3A. El valor de260/280 de OD es aproximadamente 1,9 y el valor de OD260/230 es aproximadamente 2.3. Transferencia el restante 940 μL de ADN de HMW en un tapón de tubo de 50 mL con una P1000 amplia alesaje de punta. Aspire todo ADN en una jeringa de 1 mL sin la aguja. Colocar la aguja de 27 G en la jeringa y expulse todo ADN en la tapa suavemente y lentamente (~ 10 s). Sacar la aguja de 27 G de la jeringa. Repita los pasos 2.1.4 y 2.1.5 para 29 veces para un total de 30 pasa a través de la aguja.Nota: El ADN de HMW esquilado pueden almacenarse a 4 ° C en la oscuridad de hasta 24 h. control de calidad (QC) es altamente recomendado por electroforesis en gel de campo pulsado, pero es costoso y desperdiciador de tiempo. Si se realiza control de calidad en una máquina de electroforesis de pulso automático campo gel utilizar un protocolo de 5-150 kb para un 20 h ejecutar. Los resultados esperados se muestran en la figura 4. Preparar la reacción de reparación de ADN en un tubo de 0.2 mL por adición de 100 μL de ADN de HMW esquilado (20 μg), 15 μL de tampón de reparación de ADN FFPE, 12 μL de mezcla de reparación de ADN FFPE y 16 μL de agua libre de nucleasa. La reacción de la mezcla por sacudiendo suavemente 6 veces y girar hacia abajo para quitar las burbujas. Incubar la reacción a 20 ° C por 60 min transferencia de la muestra en un tubo de 1,5 mL nueva con una punta de calibre ancho P200. Resuspender las bolas magnéticas por pipeteo o vórtex. Agregar granos μL 143 (1 x) a la reacción de reparación de ADN y mezcla suavemente agitando el tubo 6 veces. Gire el tubo en un mezclador de rotor a temperatura ambiente a 20 rpm por 30 min. Desactivación de la muestra a 1.000 x g durante 2 s en lugar de RT. el tubo en un estante magnético durante 10 minutos, mantenga el tubo en la rejilla magnética y descarte el sobrenadante. Manteniendo el tubo en la rejilla magnética, añadir 400 μL de etanol 70% recién preparada sin perturbar el pellet. Eliminar el etanol del 70% después de 30 s. Repita el paso 2.1.11 una vez. Desactivación de la muestra a 1.000 x g durante 2 s en RT. Coloque el tubo de vuelta sobre la parrilla magnética. Retire cualquier etanol residual y del aire seco de 30 s. No secar sobre el sedimento. Retire el tubo de la rejilla magnética y añadir 103 μL de TE (10 mM Tris y 1 mM EDTA, pH 8.0). Suavemente flick el tubo para asegurar que los granos están cubiertos en el buffer e incuban en un mezclador de rotor a temperatura ambiente durante 30 minutos suavemente flick el tubo cada 5 min para facilitar la resuspensión de la pelotilla. Los granos en la rejilla magnética de pellets para por lo menos 10 minutos transferir 100 μL de eluido con una P200 amplia punta en un tubo de 0.2 mL. Preparar la final reparación y dA seguimiento la reacción en un tubo de 0.2 mL mediante la adición de 100 μL de ADN de HMW reparado, 14 μL de tampón de reparación/dA-relaves final y 7 μL de la mezcla de reparación/dA-relave final. La reacción de la mezcla por sacudiendo suavemente 6 veces y girar hacia abajo para quitar las burbujas. Incubar la reacción a 20 ° C durante 60 min seguido de 65 ° C por 20 min y luego mantener a 22° C. Transferencia de la muestra en un tubo de 1,5 mL nuevo utilizando una P200 gran diámetro punta. Resuspender las bolas magnéticas por pipeteo o vórtex. Añadir 48 μL de granos (0.4 x) a la reacción de reparación/dA-relaves final y mezcla suavemente por sacudiendo el tubo 6 veces. Gire el tubo en un mezclador de rotor a temperatura ambiente a 20 rpm por 30 min. Repita los pasos 2.1.10-2.1.13 una vez. Retire el tubo de la rejilla magnética y añadir 33 μL de TE (10 mM Tris y 1 mM EDTA, pH 8.0). Suavemente flick el tubo para asegurar que los granos están cubiertos en el buffer e incuban en un mezclador de rotor a temperatura ambiente durante 30 minutos suavemente flick el tubo cada 5 min para facilitar la resuspensión de la pelotilla. Los granos en la rejilla magnética de pellets para al menos 10 min transferencia 30 μL de eluido con una P200 amplia punta en un nuevo tubo de 1,5 mL. Tomar el extra 1-2 μL para detectar la concentración con un fluorómetro.Nota: Se espera una recuperación de 5-6 μg en este paso. Preparar la reacción de la ligadura en el tubo de muestra de 1,5 mL por añadir 30 μL de ADN de HMW final reparado, 20 μL de mezcla de adaptador (AMX 1D) y 50 μL de la mezcla principal de ligadura blunt/TA. Mezcla de la reacción por sacudiendo suavemente 6 veces entre cada adición secuencial y vuelta hacia abajo para quitar las burbujas. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 60 minutos. Resuspender las bolas magnéticas por pipeteo o vórtex. Añadir 40 perlas μL (0.4 x) a la reacción de la ligadura y la mezcla suavemente por sacudiendo el tubo 6 veces. Gire el tubo en un mezclador de rotor a temperatura ambiente a 20 rpm por 30 min. Repita el paso 2.1.10 una vez. Añadir 400 μL de tampón de unión (ABB) de grano de adaptador en el tubo. Flick el tubo suavemente 6 veces a suspender las cuentas. Coloque el tubo en la rejilla magnética para separar los granos del buffer y descartar el sobrenadante. Repita el paso 2.1.26 una vez. Desactivación de la muestra a 1.000 x g durante 2 s en RT. Coloque el tubo de vuelta sobre la parrilla magnética. Elimine cualquier tampón residual y del aire seco de 30 s. No secar sobre el sedimento. Quite el tubo de la rejilla magnética y resuspender el precipitado en 43 μL de tampón de elución. Suavemente flick el tubo para asegurar que los granos están cubiertos en el buffer e incuban en un mezclador de rotor a temperatura ambiente durante 30 minutos suavemente flick el tubo cada 5 min para facilitar la resuspensión de la pelotilla. Los granos en la rejilla magnética de pellets para al menos 10 min transferencia 40 μL del eluido con una P200 amplia punta en un nuevo tubo de 1,5 mL. Tomar el extra 1-2 μL para detectar la concentración con un fluorómetro.Nota: Se espera una recuperación de 1-2 μg en este paso. La biblioteca base de esquila mecánica está lista para la carga. La biblioteca se puede almacenar en hielo para un máximo de 2 h hasta la carga de la secuencia si es necesario. Construcción de biblioteca basada en la fragmentación transposasa Descongelar los reactivos de la transposasa kit (véase Tabla de materiales). Descongele la fragmentación mix (FRA) y adaptador rápido (RAP) en el hielo y pipeta para mezclar. Descongelar el búfer de la secuencia (SQB), granos (LB) de carga, descarga buffer (FLB) y flush tether (FLT) en RT y pipeta para mezclar. Descongelar los granos de carga (LB) en RT y pipeta para mezclar antes de usar. Una vez descongelado, mantenga todos los componentes del kit en el hielo. Sacar las enzimas sólo cuando sea necesario. Compruebe la calidad y cantidad del ADN de HMW de paso 1.21.2. Pipeta de 20 μL de ADN en nuevos tubos de 1,5 mL de tres lugares diferentes en el tubo de ADN de HMW con P200 amplia dio consejos. Toma 1 μL de las tres alícuotas para detectar la concentración con un fluorómetro y la calidad, utilizando una lectura de UV. Revise varias veces para confirmar los resultados.Nota: Los resultados esperados se muestran en la figura 3B. El valor de260/280 de OD es aproximadamente 1,9 y el valor de OD260/230 es aproximadamente 2.3. Preparar la reacción de tagmentation de ADN en un tubo de 0.2 mL agregando 22 μL de ADN de HMW, 1 μL de 10 mM Tris (pH 8.0) con 0,02% Tritón X-100 y 1 μL de fragmentación (FRA) de la mezcla. Mezclar mediante pipeteo con una P200 ancho diámetro punta tan lentamente como sea posible 6 veces, teniendo cuidado de no para introducir burbujas. Incubar la reacción a 30 ° C durante 1 min seguido por 80 ° C por 1 min y luego mantener a 4 ° C. Transferencia de la mezcla en un tubo nuevo de 1,5 mL con una P200 amplia diámetro punta e ir al siguiente paso inmediato. Añadir 1 μL de adaptador rápido (RAP) para el tubo de muestra de 1,5 mL. Mezclar mediante pipeteo con una P200 ancho diámetro punta tan lentamente como sea posible 6 veces, teniendo cuidado de no para introducir burbujas. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 60 minutos.Nota: La biblioteca basada en la fragmentación de la transposasa está lista para la carga. La biblioteca se puede almacenar en hielo para un máximo de 2 h hasta la carga de la secuencia si es necesario. 3. la secuencia en el dispositivo nanopore Verifique el dispositivo de secuencia nanopore (véase Tabla de materiales). Asegúrese de que tanto el software y el hardware están trabajando y hay suficiente espacio de almacenamiento. Compruebe la célula de flujo. Abrir una nueva célula de flujo e insertar la celda de flujo en el dispositivo nanopore. Compruebe que el cuadro de la ubicación de la celda de flujo fue insertado en (X1-X5). Seleccione el tipo de la célula de flujo correcto. Haga clic en el flujo de trabajo de Controlar flujo de células . Haga clic en el botón Iniciar prueba para iniciar la célula de flujo análisis de CC.Nota: Si el número de activo total divulgado del poro es menos de 800, utilice una nueva célula de flujo diferentes de secuenciación. Preparar el buffer de cebado. Para una biblioteca de base de corte mecánica, añada 576 μL de funcionamiento amortiguador de combustible (RBF) y 624 μL de agua libre de nucleasas en un tubo de 1,5 mL. Vórtice y vuelta hasta mezcla el búfer de cebado. Para una biblioteca basada en la fragmentación transposasa, Añadir 30 μL de anclaje al ras (FLT) al tubo de tampón de lavado (FLB). Vórtice y vuelta hasta mezcla el búfer de cebado. En la celda de flujo, gire la tapa del puerto cargado hacia la derecha para exponer el puerto de cebado. Establezca una pipetas P1000 en 100 μL e inserte la punta en el orificio de cebado. Retroceder un pequeño volumen de tampón (menos de 30 μL) para eliminar las posibles burbujas de la célula de flujo. Deje de pipeteado una vez una pequeña cantidad de líquido amarillo entra en la punta. Utilice una pipeta P1000 carga 800 μL de la mezcla de cebado en la célula de flujo vía el puerto de cebado. Para evitar la introducción de burbujas, Añadir 30 μL de la mezcla de cebado a la tapa del puerto de cebado en primer lugar, y luego introduzca la punta en el orificio de cebado y agregue lentamente el resto de la mezcla de cebado. Sacar la punta cuando hay alrededor de 50 μL de izquierda. Agregar el resto de la mezcla de oscurecimiento en la parte superior del puerto de cebado. El fluido irá dentro de sí mismo. Dejar la configuración a incubar durante 5 minutos. Mientras tanto, preparar la mezcla de la biblioteca en el tubo de 1,5 mL que contiene la biblioteca.Nota: Para una biblioteca de base de esquila mecánica añadir 35 μl de que buffer de combustible (RBF) 40 μl de la biblioteca de ADN. Para una biblioteca basada en la fragmentación de la transposasa añadir 34 μl de tampón de secuenciación (SQB) y 16 μl de agua libre de nucleasa para 25 μl de la biblioteca de ADN. Abra la cubierta de puerto de flujo celular muestra con suavidad para exponer el puerto de la muestra. Utilice una pipeta P1000 para añadir 200 μL de la mezcla de cebado a través del puerto de cebado en la célula de flujo, como se describe en el paso 3.5. Asegúrese de que la mezcla de cebado no está cargada en la celda de flujo a través del puerto de la muestra. Ponga una pipeta P200 en 80 μL. Mezclar suavemente la biblioteca con una punta de gran diámetro mediante pipeteo arriba abajo 6 veces antes de cargar. Cargar la mezcla de biblioteca gota a gota a través del puerto de la muestra en la celda de flujo. Agregar cada gota sólo después de la caída anterior es completamente cargada en el puerto. Vuelva a colocar la tapa del puerto muestra suavemente y asegúrese de que el puerto de la muestra es totalmente cubierto. Mueva la cubierta del puerto de cebado en sentido antihorario hasta que cubra el orificio de cebado. Cierre la tapa del dispositivo. Haga clic en el flujo de trabajo Nuevo experimento . Escriba el nombre de la biblioteca, seleccionar el kit correcto según los procedimientos utilizados y compruebe que la configuración es correcta (48 h ejecutar, en tiempo real ON base-calling). Haga clic en Inicio ejecutar. Después de 10 minutos, registrar la ID de celda de flujo y los números de activos nanopore (número total y número de cada cuatro grupos) de la información de ejecución. Análisis de los datos. Copiar los datos en un equipo local o un grupo en cualquier momento de la secuenciación o cuando termine la carrera. Utilice Minimap216 (https://github.com/lh3/minimap2) para alinear los datos en secuencia el genoma de referencia. Resumir el funcionamiento de la secuencia de los datos sin procesar de la secuencia y las alineaciones por NanoPlot17 (https://github.com/wdecoster/NanoPlot).