ゼブラフィッシュ幼虫における食品媒介感染症のための車両として原虫ゾウリムシを使用してください。

ゼブラフィッシュ飼育、繁殖、, ここで説明実験ケアおよび実験動物の使用のためのガイドに従い、およびプロトコルであるテキサス大学健康科学センターの機関の動物福祉委員会によって承認されています。番号 AWC-16-0127。 1. 成長とゾウリムシの維持 ゼブラフィッシュ国際リソース センター (ジルコニウム) などのソースからライブ ゾウリムシのカルチャを取得します。 ライブ成長文化からゾウリムシ文化、1 で再停止される大腸菌MG1655 文化 (外径600 1.0-2.0 光密度) の 1 mL の 1 mL を追加 x E3 (0.29 g/L の NaCl、KCl、13 mg/L 44 mg/L CaCl2、81 mg/L MgSO4、0.48 g/L HEPES、pH 7.0、滅菌)、1 の 8 mL と 10 mL の培養フラスコに x E3。軽く旋回し、22 ° C で保存 文化を維持するために、2 週間ごと通路ゾウリムシ文化の 1 mL に新鮮な 1 x E3 培 10 の 9 mL と 10 mL の培養フラスコ8 CFU/mL 1 で再停止される大腸菌MG1655 の x E3。 2. ゼブラフィッシュに投与された細菌の用量の決定 ゾウリムシ内細菌の半減期を決定します。注:ゾウリムシ内細菌の半減期は、以下のとおり実行可能な大腸菌が治ったゾウリムシ、めっきによって決定されます。 次の細菌 (外径600 1.0) 22 ° C でゾウリムシの 2 時間培養、ゾウリムシと 50 mL の円錐管に細菌培養を組み合わせて、x、E3 とカウント 1 でゾウリムシを洗う (下記のとおりの手順では 1 ミリリットルあたりゾウリムシの数3.2.7 および 3.2.8)。 ゾウリムシの数を数え、ゾウリムシと細菌培養 (暴露 6 h 後) のすべての時間の 50 μ L を削除し、新しい 1.5 mL チューブに各サンプルを追加します。 1% 非イオン性界面活性剤の場所 950 μ L (材料表参照) 各 1.5 mL チューブとゾウリムシを溶解する 1 分の渦にリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) ソリューション。1:10 を実行 (すなわち、900 μ L、100 μ L) 希釈剤として滅菌 PBS を使用する各サンプルの希釈液です。 選択式ナンバー プレート上に各希釈の 100 μ L をプレート (LB テト媒体: 30 μ G/ml テトラサイクリン 1 g/L の NaCl, 0.5 g/L 酵母エキス 1 g/L トリプトン) と 16 h の 37 ° C で孵化させなさい。次の日はカウントし、のみ分離と異なる個々 のコロニーを数えることによってプレート (コロニー形成単位 CFUs) の細菌のコロニー数を記録します。30-300 CFU を与える希釈とプレートを識別します。 希釈を決定する係数を使用しています。たとえば、細菌文化の 1 μ L は 99 mL の滅菌 PBS と混合、これは (0.01) 1: 100 希釈です。この番号は、希釈 CFU の数になります。元のサンプル CFU を判断するためのすべての時間ポイントの下、計算を実行します。 計算し実行可能なエシェリヒア属大腸菌の数をグラフ/時間に対応するゾウリムシ ステップ 3.3.1 で計算されたゾウリムシの濃度を使用して露出を投稿し、ゾウリムシ (図 1) 内での半減期を決定します。 CFU を使用して各時間ポイント数が計算される計算し、実行可能な大腸菌軸、y 軸、x 軸の時間ポスト インキュベーション対ゾウリムシあたりステップ 3.3.1 で計算されたゾウリムシの濃度を使用して、グラフに表す。ゾウリムシの半減期を決定します。 細菌細菌の半減期からの投与と捕食率を決定します。注:細菌の量を判断するには、は、ゾウリムシの中の細菌の半減期とゾウリムシのゼブラフィッシュの捕食率を考慮する必要 (3.4 の手順を参照してください)。 ゾウリムシ内細菌の崩壊を決定する次の数式を使用します。(1)N0が 2 時間培養後初期ゾウリムシあたりの細菌数は、Nt は時間 t 後、残りの数量、τ はその後細菌数は半減、時間、k は崩壊定数。 分解実験から細菌の半減期を用いた減衰定数 k を決定する (つまり、実行可能な細菌/ゾウリムシの量が半減すた後時間)。(2)半減期の決意の言葉と(3)または(4)注:図 1に基づき、ゾウリムシのエシェリヒア属大腸菌の半減期は、約 2.3 時間です。したがって、式 (4)、減衰率、k を使用して、エシェリヒア属大腸菌のためです。(5) 細菌 (Nt) ゼブラフィッシュの幼虫によってとらの用量を見つけるため半減期実験から減衰率 (k) を決定 (P) が捕食率かゾウリムシ時速 1 匹の魚に食べられて数後捕食時間 (t)。( 6)または(7)注:図 1初期ゾウリムシ (N0) 2 時間培養 (t) 後あたりの菌量が 790 CFU。ムービー 1と図 2、捕食率 (P) が 1539 です。 これらの値を使用して、式 (7) に代入、次として 2 時間インキュベーション ゼブラフィッシュによって消費される細菌の投与量を計算します。(8) 3. ゼブラフィッシュの食品媒介感染症 ゾウリムシは細菌を孵化させなさい。 ゾウリムシや大腸菌MG1655 の共培養感染前に夜を準備します。E3 メディア 8 mL、継続的なゾウリムシ文化の 1 mL と大腸菌MG1655 文化の 1 mL を組み合わせる (外径600 = 1.0) 1 で再停止されるコート t25 フラスコ培養フラスコに x E3。室温 (RT) でフラスコを一晩インキュベートします。各処理条件のゾウリムシの 2 つのフラスコを準備します。 細菌の成長媒体を接種する (ポンド: 1 g/L トリプトン 0.5 g/L 酵母エキス、塩化ナトリウム 1 g/L) 細菌の感染株板から個々 の細菌のコロニーを選択することにより使用して滅菌接種ループ。37 ° C で液体培養をインキュベートし、110 回転/分 (rpm) 一晩で揺れを残します。注:(研究室コートと手袋) 保護具を着用してください、感染性病原体を取り扱う際、バイオ セーフティ レベル 2 の施設・設備を使用する必要があります。 次の日、一晩かけて培養の OD600を測定します。1 mL の培地 11 で再停止されるときの外径600を達成するために必要な文化の量を計算します。 ゾウリムシの 6,000 x gで 5 分、各フラスコ 1 つのボリュームでの遠心分離を介してステップ 3.1.2 からの細菌の量を収穫します。上澄みを廃棄し、E3 メディアの 1 つの mL で細菌のペレットを再懸濁します。 必要に応じて、あらかじめ蛍光色素を細菌を染色します。 FM 4 64FX 細菌染色 (5 mg/mL 原液) 1 μ L を追加します。カバー退色から保護し、回転オーバー エンド ・常温 15 分間インキュベートする箔管。 1 で洗浄することにより余分な染料を削除 x E3: 1.5 分間 6,000 × gで遠心分離を介して細菌をペレット、E3 メディアの 1 mL にペレットを再懸濁します。洗浄ステップを 2 回繰り返します。 6,000 x gで 5 分間破棄で汚された細菌を介して遠心上清を収穫し、E3 メディアの 1 つの mL で細菌のペレットを再懸濁します。 それぞれ新鮮なゾウリムシの 2 つのフラスコの細菌懸濁液の 1 mL を追加します。2 時間室温で孵化させなさい。注:ステンド グラスの細菌を扱う場合は、2 h の RT で暗闇の中で孵化させなさい。 洗って細菌/ゾウリムシ培養。 50 mL の円錐管にゾウリムシ/細菌培養の両方のフラスコの内容を結合します。300 x gで 10 分間の 15 ° c で遠心分離機サンプル遠心分離機はこの工程の前に予冷を確認します。 血清ピペットを使用して E3 清約 10 mL を削除し、新鮮な 1 の約 10 mL を追加円錐管に x E3。注:洗浄の手順をすべての時に、非常に迅速に、上澄みを取り外す際、ゾウリムシがペレットの泳いでいくと重要です。スピン時この段階で十分に速く処理できるように 1 つの管から上清を除去し、上澄みにゾウリムシの損失を防ぐ。 5 分削除血清ピペットを使用して E3 上澄みの約 10 mL の 15 ° C で 300 × g で遠心分離を介してサンプルをスピンし、新鮮な 1 の約 10 mL を追加し円錐管に x E3。この手順を 2 回繰り返します。 15 ° C、5 分で 300 × gで遠心分離機サンプルは、ペレットを妨害しないように世話 E3 清約 10 mL を削除します。 E3 メディアの残り 10 mL にペレットを再懸濁し、懸濁液 500 μ L を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。ゾウリムシの数をカウントする 5 分間 300 × gで遠心分離によるゾウリムシの 500 μ L をペレットします。 500 μ L のサンプルから培養上清中の E3 の 400 μ L を削除します。ゾウリムシの残りの 100 μ L に 36.5% ホルムアルデヒド液 20 μ L を追加し、優しく再懸濁し、22 ° C で 5 分間インキュベート注:このステップを数えるためにゾウリムシを殺します。 ピペットとレコードを使用して実際の総容積を測定します。ゾウリムシ懸濁液 1:1 v/v で 0.4% トリパン ブルー溶液を希釈します。 ゾウリムシ/mL の死者の数をカウントするのにセル カウンターまたは検定を使用します。注:前固定ステップのためほとんどゾウリムシはこの時点で死んでいるだろうが、この数は共同培養実験のための生きているゾウリムシの数を反映します。著者は、これはここに要因として無視できるので細菌の共培養による重要なゾウリムシ死を発見していません。 共同ゾウリムシやゼブラフィッシュの幼虫を孵化させなさい。 ゾウリムシの濃度を計算します。注:この計算は、3.2.5 のステップから 50 mL の円錐管にゾウリムシの濃度を提供します。 E3 の 3 mL の最終巻で 2 x 105ゾウリムシ/mL の濃度に必要な洗浄のゾウリムシのボリュームを計算します。注:ゾウリムシの濃度は、最適化される目的の細菌量に基づいて調整できます。 ゼブラフィッシュを (ステップで計算されたゾウリムシの適切な濃度を含む新鮮な E3 の 3 mL の容量に 6 ウェル プレートの各ウェルに 100 mM トリス ph 8.0 を最終濃度 100 MG/L 転送 10 ゼブラフィッシュの tricaine を追加することで麻酔します。3.3.2). 受信者も麻酔から回復できるように、液体の最小限の量で幼虫を転送することを確認します。 食い物の最適な照明条件を確保するため、日の光条件の下で昼間のインキュベーターで 2 h 30 ° C で孵化させなさい。 新鮮な E3 のたびに 100 mg/L tricaine を含むに対応する新しいも含む 3 mL に魚を移すことによって、少なくとも 5 回ゼブラフィッシュを洗ってください。注:洗浄工程中に、tricaine を省略しないでください。麻酔なしモバイル幼虫を転送する損害と動物に苦痛のリスクが高まります。 必要に応じて、黒壁 6 ウェル プレートで 1% 低溶解アガロースの 3 mL にゼブラフィッシュを埋め込むことによってイメージング用ゼブラフィッシュを準備: 低溶解アガロースは 1xE3 で作り上げた、電子レンジで加熱します。一度溶融、160 mg/mL の最終的な集中に tricaine を追加します。確実な頭の左右の尾の先端を読み込むクリップされたゲルを用いた顕微鏡下位置魚は右側 (図 3)。設定する、agarose のため 5 分間待機し、1 x E3 含む 160 mg/mL tricaine イメージングのための埋め込まれた魚をオーバーレイします。 捕食率を決定します。注:別の実験を捕食率を決定するように設定する必要はありません。むしろ、この行うことができます段階 3.3.4、以下のとおり。 3.3.4 のステップ中に獲物捕獲の実体顕微鏡とキャプチャ映像の食い物ゼブラフィッシュを表示します。 ビデオ映像をスコアします。獲物捕獲獲物に向かってゼブラフィッシュの顕著な特徴です。これは単なる目安ですが 1 つの獲物捕獲イベントとして各ストライクをカウント (ディスカッションを参照してください)。 それぞれ異なるゼブラフィッシュ幼虫 (図 2) を表す複数のビデオ クリップから 1 時間あたりの獲物捕獲イベント数の平均値を計算します。