用原生动物给鱼作动物感染的载体

这里描述的斑马鱼护理、繁殖和实验符合《实验动物护理和使用指南》, 并已获得德克萨斯大学健康科学中心动物机构福利委员会的批准, 议定书编号 awc-16-0127。 1.参数的生长和维持 从斑马鱼国际资源中心 (zirc) 等来源获得活的寄生虫培养物。 从一个活的不断增长的文化, 加入1毫升的准麦子培养, 1 毫升的大肠杆菌mg1655 培养 (光学密度 od600-2.0 ) 重新悬浮在 1x e3 (0.29 g/l 氯化钠, 13 mg/l kcl, 44 mg/cl cl, 81 mglmgsso4, 0.48 gl hepes, ph 7.0, 无菌), 和8毫升的 1x e3 成10毫升的组织培养瓶。轻轻旋转, 然后存放在22°c。 为了保持培养, 每两周将副虫培养的1毫升放入10毫升的组织培养瓶中, 其中含有9毫升的新鲜 1x e3 培养基, 其中含有 10 8 8 cmu/pe mg1655, 悬浮在 1x e3 中. 2. 斑马鱼的细菌剂量测定 测定对那类细菌的半衰期请注意:如下文所述, 从中回收的可行大肠杆菌是通过电镀可行的大肠杆菌来确定的。 在22°c 时, 细菌 (od600合 1.0) 与对角虫孵育2小时后, 将对位菌和细菌共培养结合成一个50毫升的锥形管, 用 1x e3 清洗准虫, 并计算每毫升的准分子数 (如下步骤所述)3.2.7 和 3.2.8)。 在计算了寄生虫的数量后, 每小时 (暴露后 6小时) 取出50μl 的副虫和细菌共培养, 并将每个样本添加到一个新鲜的 1.5 ml 管中。 将1050μl 的1% 非离子表面活性剂 (见材料表) 放入磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 溶液中的每个 1.5 ml 管和涡旋中, 为1分钟裂解对副大海素的裂解。使用无菌 pbs 作为稀释剂 (即100μl 在900μl 中) 对每个样品进行 1:10 稀释。 板材100μl 的每一次稀释在选择性板材上 (lb tet 介质: 1 gl 色氨酸、0.5 g/L l 酵母提取物、1 g/l ncl、30μgml 四环素), 在37°c 孵育16小时。第二天, 只计算孤立和独特的单个菌落, 计算和记录盘子上的细菌菌落数量 (菌落形成单位, cfu)。识别具有稀释的板, 该稀释剂为 30–300 cfu。 确定使用的稀释系数。例如, 如果将细菌培养的1:100 与99毫升的无菌 pbs 混合, 这是 1:100 (0.01) 稀释。这个数字将是稀释中的 cfu 的数量。对每个时间点执行以下计算, 以确定原始示例中的 cfu: 使用步骤计算的副虫浓度3.3.1 计算和绘制与接触后时数相对应的可行大肠杆菌/副虫的数量, 并确定准应体内的半衰期 (图 1)。 使用为每个时间点计算的 cfu 数, 使用步骤3.3.1 计算的副征浓度, 计算和绘制 y 轴上每个副磷脂的可行大肠杆菌数与 x 轴孵育后的时间数。确定在准应体内的半衰期。 从细菌半衰期和捕食率中确定细菌剂量。请注意:为了确定细菌的剂量, 必须考虑到对内细菌的半衰期和斑马鱼在上的捕食率 (见步骤 3.4)。 使用以下公式来确定寄生虫体内的细菌衰变:(2)如果 n0是2小时孵育后每个准钙的初始细菌数量, 而 nt 是一个经过一段时间后的剩余数量, 是一个活细菌数量减半的时间, k 是衰变常数。 从降解实验中, 使用细菌半衰期确定衰变常数 k (即, 在这段时间之后, 可行的细菌/的数量减少了一半)。(3)对于半衰期的确定, 术语和(3) 或(2)请注意:根据图 1,大肠杆菌在副母细胞中的半衰期约为 2.3 h。因此, 使用公式 (4), 大肠杆菌的衰减率, k是:(3) 确定半衰期实验的衰变率 (k), 以找到斑马鱼幼虫在捕食时间 (t) 后所采取的活细菌 (nt) 的剂量, 其中 (p) 是每小时一条鱼吃的捕食率或食证数量:(6) 或(4)请注意:根据图 1, 2小时孵育 (t) 后每对位菌 (n0) 的初始细菌数量为 790 cfu。根据电影 1和图 2, 捕食率 (p) 是1539。 使用这些值替代方程 (7), 计算斑马鱼在2小时孵育后消耗的细菌剂量如下:(6) 3. 斑马鱼的食源性感染 用帕拉米西亚培养细菌。 在感染前一晚准备对副虫和大肠杆菌mg1655 的共同培养。结合8毫升的 e3 培养基, 1 毫升的正在进行的副虫培养, 1 毫升的大肠杆菌mg1655 培养物 (od600 = 1.0) 重新悬浮在 1x e3 在 t25 组织培养瓶。在室温 (rt) 下隔夜生瓶。对于每个治疗条件, 准备两个副马鞭刑瓶。 接种细菌生长介质 (lb:1 gl 色氨酸, 0.5 gl 酵母提取物, 1 g/l ncl) 与传染性菌株的细菌, 通过从一个板使用无菌接种循环选择一个单独的细菌菌落。在37°c 下培养液体, 并以每分钟 110次 (rpm) 过夜的速度保持晃动。请注意:应佩戴个人防护设备 (实验室外套和手套), 并在处理传染剂时使用生物安全二级设施。 第二天, 测量隔夜文化的 od600. 计算在11毫升介质中重新悬浮时实现 od 600 的培养所需的培养量。 通过离心 5分钟3.1.2 的离心, 收获细菌的体积, 每瓶 1 块。丢弃上清液, 在 e3 培养基1毫升中重新悬浮细菌颗粒。 或者, 用荧光染料预先染色细菌。 添加1μl 的 fm 4-64FX 细菌染色 (5 mg/ml 库存解决方案)。盖上铝箔, 以防止光漂白, 并在 rt 孵育旋转端端端15分钟。 用 1x e3:6, 000 x g离心剂去除多余的染料, 每次1.5 分钟, 然后在 e3 介质的1毫升中重新悬浮颗粒。重复清洗步骤两次。 以 6, 000 x克的离心速度收集染色细菌, 5分钟. 去除上清液, 并在 e3 培养基的1毫升中重新悬浮细菌颗粒。 在新鲜副虫的两个瓶中加入1毫升的细菌悬浮液。在 rt 孵化2小时。请注意:如果使用染色细菌, 在 rt 黑暗中孵育2小时。 洗菌/寄生虫共培养。 将两瓶的副虫菌种共培养成50毫升锥形管。在15°c 条件下以 300 x g离心样品 10分钟. 确保离心机在此步骤之前进行预冷。 使用血清学移液器去除约10毫升的 e3 上清液, 并在锥形管中加入约10毫升的新鲜 1x e3。请注意:在所有的清洗步骤中, 在取出上清液时必须非常快, 因为副虫会开始从颗粒中游出来。一次旋转并从一个管中取出上清液, 以确保在这一步中足够快的处理, 并避免上清液中的副虫丢失。 在 15°c 下通过 300 x 克离心旋转样品 5分钟, 使用血清学移液器取出约10毫升的 e3 上清液, 并在锥形管中加入约10毫升的新鲜 1x e3。重复此步骤两次。 在15°c 下以 300 x g离心样品 5分钟, 取出约10毫升的 e3 上清液, 注意不要破坏颗粒。 将颗粒重新注入剩余的10毫升 e3 介质中, 并将悬浮液的500μl 转移到新的 1.5 ml 微离心管中。通过在 300 x g离心5分钟以计算出寄生虫数的速度, 将500μl 的副虫颗粒状。 从500μl 样品中取出 e3 上清液400μl。将36.5% 甲醛溶液加入 20μl, 然后轻轻再悬浮, 在22°c 孵育5分钟。请注意:此步骤杀死参数, 以便进行计数。 使用移液器和记录测量实际总体积。用0.4% 的色氨酸蓝色溶液稀释副虫悬浮液 1: 1 v。 使用细胞计数器或血细胞仪来计算死亡的参数。请注意:由于之前的固定步骤, 大多数准应将在这一点上死亡, 但这个数字反映了共同孵化实验的活的准应的数量。作者没有发现细菌共同孵化导致的明显副性死亡, 因此这可以被忽略为一个因素。 共孵育和斑马鱼幼虫。 计算副那卵的浓度:请注意:计算出了从阶跃3.2.5 到50毫升锥形管中的副性。 计算在 e3 的最终体积为3毫升的最终体积中浓度为 2 x 10 5 的 parcecil 所需的洗涤的的体积。请注意:对位基因的浓度可以根据所需的细菌剂量进行调整, 这需要优化。 通过在 100 mm tris ph 8.0 中加入旋塞因, 将10头斑马鱼转移到6井板的每口井中, 将含有适当浓度的鱼的新鲜 e3 总体积为3毫升 (按步骤计算), 从而对斑马鱼进行麻醉3.3.2). 确保以最少的液体转移幼虫, 以确保它们从接受者的麻醉中恢复。 在日光条件下, 在30°c 下在白天孵化器中孵育 2小时, 以确保最佳的捕食雷电条件。 将含有3毫升新鲜 e3 的新井中, 每次含有 100 mg ticaine, 将斑马鱼至少清洗5次。请注意:在清洗过程中, 不要试图省略毛滴虫。在没有麻醉的情况下转移移动幼虫会增加对动物造成伤害和痛苦的风险。 (可选) 将斑马鱼嵌入3毫升的 1% 低熔体琼脂在黑墙6井板中进行成像: 低熔融琼脂糖在1xe3 中制成, 并在微波中加热。一旦熔融, 将毛滴原添加到 160 mg/ml 的最终浓度中。将鱼放置在立体显微镜下, 使用剪下的凝胶加载尖端, 确保头部在左侧, 尾巴在右侧 (图 3)。等待 5分钟, 使琼脂糖设置, 然后覆盖嵌入的鱼与 1x e3 含有 160 mgmml 旋塞因成像。 确定捕食率。请注意:不需要设置单独的实验来确定捕食率。相反, 这可以在步骤3.3.4 中完成, 如下所述。 在步骤3.3.4 中, 在立体显微镜下观看捕食斑马鱼的情况, 并拍摄猎物捕获的视频画面。 在录像中打分。猎物捕捉的特点是斑马鱼向猎物撞击。将每次攻击计算为一个猎物捕获事件, 尽管这只是一个近似值 (请参阅讨论)。 从多个视频剪辑计算每小时捕获猎物事件的平均数量, 每个视频剪辑代表不同的斑马鱼幼虫 (图 2)。