Индукция мышь травмы легких эндотрахеальной инъекции Bleomycin
Summary
Здесь мы представляем эффективный метод для исследования антифибротической активности внутривенно вливания человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины после индукции травмы легких эндотрахеальной инъекции блеомицина в C57BL /6 мышей. Этот протокол можно легко распространить на доклинические испытания других терапевтических препаратов.
Abstract
Легочный фиброз является отличительной чертой нескольких заболеваний легких человека с другой этиологией. Поскольку нынешняя терапия довольно ограничена, мышиные модели по-прежнему являются важным инструментом для разработки новых антифиброзных стратегий. Здесь мы предоставляем эффективный метод для исследования in vivo антифиброзной активности человека мезенхимальных стромальных клеток, полученных из всего пуповины (hUC-MSC) в ослаблении bleomycin-индуцированной травмы легких. C57BL/6 мышей получают одну эндотрахеульную инъекцию блеомицина (1,5 U/kg массы тела), а затем двойной вливание hUC-MSC (2,5 х 105) в хвостовой вены, 24 ч и 7 дней после введения блеомицина. При жертвоприношении в дни 8, 14 или 21, воспалительные и фиброзные изменения, содержание коллагена, и присутствие hUC-MSC в эксположив легочной ткани анализируются. Инъекции блеомицина в трахею мыши позволяет прямого ориентации легких, что приводит к обширному воспалению легких и фиброза. Системное введение двойной дозы hUC-MSC приводит к раннему притупию травмы легких, вызванной блеомицином. Внутривенно вливания hUC-MSC временно привиты в легкие мыши, где они оказывают свою противовоспалительные и противофиброзные активности. В заключение, этот протокол был успешно применен для доклинических испытаний HUC-MSC в экспериментальной мышиной модели фиброза легких человека. Тем не менее, этот метод может быть легко расширен как для изучения влияния различных эндотрачелогически вводимых веществ на патофизиологию легких и для проверки новых противовоспалительных и противофиброзных системных методов лечения.
Introduction
Легочный фиброз является прогрессивным патологическим процессом, характеризующимся чрезмерным осаждением внеклеточных матричных компонентов, в основном коллагена I типа, в интерститии легких, что приводит к нарушению функции легких. Это отличительная черта нескольких заболеваний легких человека с другой этиологией и представляет собой плохой клинический прогностик фактор. Поскольку текущие методы лечения довольно ограничены1, мыши модели продолжают быть важным инструментом как для дальнейшего исследования патогенных механизмов, влияющих на начало и прогрессирование болезни и для разработки новых антифибротических стратегии2,3.
На сегодняшний день, введение блеомицина была наиболее часто применяемой моделью экспериментально индуцированного фиброза легких4. Помимо нескольких методов доставки (в том числе внутривенных, внутриперитоненных, подкожных и ингаляционных), внутричехальные или эндотрахеальные инъекции блеомицина стали наиболее часто используемыми маршрутами4,5. Метод, который мы описываем в данном ниле был разработан, чтобы избежать обжигающий эффект блеомицина на слизистую оболочку трахеи. В самом деле, путем экстерьеризации трахеи и визуализации его через операционный микроскоп, можно достичь закапывания всего объема раствора блеомицина непосредственно в нижние дыхательные пути без каких-либо разливов в верхней дыхательной части. При наличии необходимых хирургических знаний и приборов, этот метод позволяет обеспечить безопасную, надежную и воспроизводимую индукцию воспаления легких и фиброза, как сообщалось ниже.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эндотрахельное управление является преференциальным маршрутом для доставки экзогенных агентов в легкие. С нескольких лет, прямое введение bleomycin в трахею широко используется для индуцирования легочного фиброза13 и, в последнее время, более продвинутые, неинвазивные методы…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом RF-2011-02352331 от Министра Италио делла Салюта (Армандо Габриэлли).
Materials
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
Referências
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis?. Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 294 (2), L152-L160 (2008).
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis?. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
