Summary

Isolatie van primaire lymfkliertest skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen

Published: March 06, 2019
doi:

Summary

Microvasculaire endotheliale cellen van skeletspieren (MMEC) vorm van de binnenwand van de spier haarvaten en reguleren beide, uitwisseling van vloeistoffen/moleculen en migratie van (afweercellen) tussen spierweefsel en bloed. Isolatie van primaire lymfkliertest MMEC, kunt zoals hier beschreven, u uitgebreide in vitro onderzoeken van de “myovascular-eenheid”.

Abstract

De endotheliale cellen van skeletspieren haarvaten (microvasculaire endothelial spiercellen, MMEC) opbouwen van de barrière tussen de bloedstroom en debeenderspieren regulering van de uitwisseling van vloeistoffen en voedingsstoffen, evenals de immuunrespons tegen besmettelijke agenten door immuun cel migratie te beheren. Voor deze functies, MMEC vormen een functionele “myovascular eenheid” (MVU), met verdere celtypen, zoals pericytes, fibroblasten en cellen van de skeletspieren. Bijgevolg een dysfunctie van MMEC en dus de MVU draagt bij aan een grote verscheidenheid van myopathieën. Echter regulerende mechanismen van MMEC bij gezondheid en ziekte blijven onvoldoende begrepen en hun opheldering voorafgaat aan meer specifieke behandelingen voor myopathieën. De isolatie en diepgaand onderzoek van de primaire functies van de MMEC in het kader van de MVU zou kunnen vergemakkelijken een beter inzicht in deze processen.

Dit artikel bevat een protocol om te isoleren van primaire lymfkliertest MMEC van de skeletspieren door mechanische en enzymatische dissociatie, met inbegrip van de zuivering en cultuur onderhoud stappen.

Introduction

Via de bloedbaan, cellen en organen zijn voorzien van zuurstof, substraten en andere noodzakelijke moleculen. Deze uitwisseling vindt plaats in de haarvaten, de kleinste vaartuigen. Haarvaten worden gevormd door een cellaag van de innerlijke endothelial (EG) waarvan de integriteit een voorwaarde voor succesvolle regulering van de homeostase van de spier tussen de intravasculaire en interstitiële ruimte blijft. Om te zorgen voor een selectieve overgang van oplosbare factoren en cellen, EG vormen een enkelgelaagde onderling verbonden door strak en adherens kruispunten 1. Naast haar rol als barrière voor voedingsstoffen of stofwisselingsproducten, EG regelen de aanwerving van leukocyten in inflammatoire processen. Ontsteking of weefsel schade leidt tot een up-regulatie van celadhesie-moleculen op het oppervlak van de EG en de productie van chemokines leukocyte bijlage en transmigratie in de target weefsel 2te vergemakkelijken. Bijgevolg zijn de EG kritisch betrokken bij de regulatie van inflammatoire processen zoals de verdediging tegen ziekteverwekkers of weefselherstel.

Een dysfunctie van de EG is direct gekoppeld aan vasculaire ziekten, chronisch nierfalen, veneuze trombose ernstige pathogen infecties. Bovendien EG zijn bijna altijd betrokken bij orgaan-specifieke autoimmuniteit zoals diabetes mellitus of multiple sclerose 3. De functie als barrière tussen bloed en organen wordt daarom beheerd door een gezamenlijke samenspel van verschillende celtypes. In de skeletspieren microvasculaire endotheliale cellen (MMEC) samen met de spiercellen, fibroblasten en pericytes vormen een functionele eenheid, de “eenheid van de myovascular” (MVU). Daarom kan een dysfunctie van de MVU een cruciale rol spelen in de pathofysiologie van myopathieën. Echter een dieper begrip van deze regulerende mechanismen ontbreekt nog steeds en momenteel verzet zich tegen de identificatie van nieuwe, therapeutische en dringend noodzakelijke doelen in myopathieën.

Om te onderzoeken het complex fysiologische en pathofysiologische mechanismen, worden dierlijke modellen vaak gebruikt. Echter, in vitro modellen bieden het voordeel te concentreren op het onderwerp van belang door een scala aan storende factoren uit te sluiten. Om te onderzoeken processen in vitro er moet zuiver en levensvatbare primaire cellen isoleren. In tegenstelling tot de cellijnen toelaten primaire cellen geïsoleerd van transgene dieren om de gevolgen van genetische modificaties in vitro onderzoeken.

Een methode om te isoleren van de primaire lymfkliertest MMEC wordt hier beschreven met behulp van mechanische en enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische geactiveerde cel Sorteren technieken (MCS) voor de zuivering. Voor dit doel, worden magnetische kralen tegen specifieke oppervlakte markers gebruikt. Bloedplaatjes endothelial cel adhesie molecuul-1 (PECAM1, CD31) wordt vooral uitgedrukt op EG en kan worden gebruikt voor het verrijken van dit celtype. Om te rechtvaardigen hoge cel zuiverheid, zijn cellen van hematopoietische oorsprong uitgesloten door een negatieve selectie voor proteïne tyrosine fosfatase receptor type C (PTPRC, CD45). Verder, kwaliteitscontroles, teelt van primaire lymfkliertest MMEC, toepassingsmogelijkheden en beperkingen, alsmede speciale overwegingen worden gepresenteerd.

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de lokale autoriteiten en uitgevoerd volgens de Duitse dierenwelzijn wet (84-02.05.20.13.097). 1. algemene opmerkingen over dierproeven Uitvoeren van alle muis experimenten overeenkomstig de richtsnoeren van de respectieve institutionele dierenverzorgers en gebruik van de Commissie. Houden van muizen onder gestandaardiseerde condities en volgens internationale richtlijnen zoals de Federatie voor Laboratory Animal Science verenigingen…

Representative Results

Een dag na isolatie, primaire lymfkliertest MMEC en resterende andere cellen vormen van conglomeraten en zich houden aan de onderkant van cultuur gerechten (figuur 1A dag 1). Vanaf dag 7, kunnen plat en langgerekte cellen worden waargenomen. Besmetting van andere, meestal sferoïde cellen, is echter nog steeds zichtbaar (figuur 1A dag 7). Dus, een andere cyclus van CD31 positieve selectie via MCS is vereist. Hierna, prim…

Discussion

Microvasculaire endotheliale cellen bieden barrière functies in alle weefsels en hun resultaten van de disfunctie bij ziekte van de bijbehorende organen 3. Bovendien, orgel-specifieke studies van microvasculaire EG kunnen de weg vrijmaken voor nieuwe therapeutische strategieën. Daarom is een dieper begrip van microvasculaire EG functie onder fysiologische en pathofysiologische omstandigheden van wetenschappelijke belangstelling. Modulatie van leukocyten/endotheel interactie is met succes gebruik…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de “anders Kröner-Fresenius-Stiftung” (2018_A03 aan TR), “Innovatieve Medizinische Forschung (IMF) Münster” (I-RU211811 aan TR) en Duitse Research Foundation (DFG INST 2105/27-1, ME 3283/5-1 en ME 3283/6-1 tot SGM). Geïllustreerde knopvlakken door Heike Blum.

Materials

0,25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1ml (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) ) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

Referências

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S., Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Müntefering, T., Michels, A. P., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

View Video